本研究制备了一种氧化石墨烯（Graphene oxide，GO）纳米载药微粒，并将其作用于脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）诱导的奶牛乳腺上皮细胞，探究了该载药微粒对炎症的影响。实验首先在GO表面修饰TLR4抗体蛋白、羟基喜树碱和荧光素标记的胱天蛋白酶（Caspase）-3特异性底物肽（Pep-FAM）等材料合成纳米载药微粒并对其进行紫外光谱表征；之后将其作用于LPS诱导的奶牛乳腺上皮细胞炎症模型进行相关炎症因子的检测，并结合流式细胞和激光共聚焦荧光成像等技术，探究了该纳米载药微粒对炎症细胞的影响。实验结果证实我们成功制备出Caspase-3特异性识别的GO纳米载药微粒，该药物对炎症细胞有显著的促凋亡作用，能显著降低炎症细胞IL-6、TNF-α的分泌以及上清中NAGase、LDH酶的活性，对奶牛乳腺上皮细胞的炎症有一定程度的缓解作用。
目录
摘要 2
关键词 2
Abstract 2
Key words 2
1 绪论 3
1.1 奶牛乳腺炎概述 3
1.2 由脂多糖（LPS）引起的奶牛乳腺炎 3
1.2.1 LPS 3
1.2.2 模式识别受体 4
1.3 TLR4/NFκB炎症信号通路 4
1.3.1 TLR4信号通路 4
1.3.2 NFκB信号通路 6
1.4 氧化石墨烯（GO）纳米载药微粒 7
1.5 本文研究 8
2 材料与方法 9
2.1 主要材料和仪器 9
2.2 GO纳米载药微粒的制备及修饰 9
2.3 GO纳米载药微粒表征及检测 9
2.4 奶牛乳腺上皮细胞炎症模型的建立 .10
2.5 药物作用后流式细胞术检测细胞凋亡 10
2.6 药物作用后激光共聚焦荧光显微镜观察细胞状态 .....10
2.7 药物作用后细胞上清中炎症指标检测 .10
2.8 数据统计分析 11
3 结果与分析 11
3.1 GO纳米载药微粒表征及检测的结果与分析 11
3.2 奶牛乳腺 *51今日免费论文网|www.jxszl.com +Q: &351916072& 
上皮细胞炎症模型建立的结果与分析 .12
3.3 药物作用后流式细胞术检测细胞凋亡的结果与分析 .13
3.4 药物作用后激光共聚焦荧光显微镜细胞状态的观察结果与分析 ...14
3.5 药物作用后细胞上清中炎症指标检测的结果与分析 15
4 讨论 16
致谢 17
参考文献 17
氧化石墨烯纳米载药微粒的制备及其对奶牛乳腺上皮细胞炎症的影响
引言
1 绪论
1.1 奶牛乳腺炎概述
奶牛乳腺炎是乳腺实质的炎症，是一种世界范围内广泛流行的复杂多病原性疾病。根据严重程度通常不同，它可分为亚临床型、临床型和慢性乳腺炎，其发病程度取决于多种因素，包括致病病原体种属、患病动物年龄品种以及生产环境等等。奶牛乳腺炎常以乳汁性质或乳腺组织的病理变化为特征，主要表现为产奶量下降、牛奶质量降低、乳腺组织红肿溃烂等[1]。
乳腺炎的发病主要经历三个阶段。第一阶段为侵入阶段，外界病原体突破乳腺防御系统的第一道防线经过乳头管进入乳腺，导致乳腺内的进一步感染，此时患病牛无明显临床症状，不易诊断。第二阶段为感染阶段，侵入的病原体激活乳腺防御系统的第二道防线，中性粒细胞、巨噬细胞、淋巴细胞等炎症细胞开始发挥功能，如果炎症细胞识别并清除了病原体，那么感染状况便会逐渐消退，否则，感染将会进一步发展。第三阶段为炎症阶段，局部组织出现明显的病理变化，甚至出现患畜的全身反应，以临床乳腺炎的形式出现。导致乳腺炎的因素也较为复杂，主要包括两大类：物理刺激和微生物感染。创伤刺激、饲养环境不适宜、饲养管理不当等因素均是乳腺炎的诱因。微生物的感染是导致乳腺炎发生的最主要因素，在20世纪40年代大多数导致乳腺炎的病原体已被确认[1]，病原体的种类包括细菌、真菌、支原体、病毒等等。据报道，无乳链球菌、停乳链球菌、乳房链球菌、金黄色葡萄球菌是最常见的乳腺炎病原体[2]。
目前对于奶牛乳房炎的诊断主要是基于乳汁和乳房的异常，严重感染时还伴有明显的全身反应。临床乳房炎由于其常表现出明显的临床症状，发病时较易诊断，但亚临床乳房炎必须辅以实验室检查才能确定。最常使用的诊断方法是牛乳中的体细胞计数法（Somatic cell count，SCC），牛乳中SCC值的高低与乳腺中微生物量呈正相关。此外，也有其他许多方法被应用于奶牛乳腺炎的检测，如牛乳微生物检查、牛乳电导率检测、N乙酰βD氨基葡萄糖苷酶（NacetylβDglucosaminidase，NAGase）活性检测等等。
乳腺炎是造成全球范围内奶牛养殖业经济损失最常见的疾病之一，约占常见生产性疾病总损失的40%[3]。2012年，一项来自印度的调查报告显示，印度奶牛养殖业由于乳腺炎造成的经济损失在过去五十年中增加了约115倍[1]。也有研究表明，全世界有约三分之一的奶牛患有不同程度的乳腺炎，而在我国这一比例高达二分之一以上[4]。一项瑞典的研究报告称，每一例临床乳腺炎和亚临床乳腺炎分别平均造成275和60欧元经济损失[5]。在美国，相关调查显示，乳腺炎每年给美国乳品制造商造成的直接经济损失约为20亿美元，约占牛奶销售总额的10%[6]。从全球范围来看，乳腺炎每年至少造成的损失约为350亿元。
对于乳腺炎的预防，疫苗接种是较为常见的控制策略，例如J5型疫苗主要用于预防大肠菌群（大肠杆菌、克雷伯氏菌属，柠檬酸杆菌属和肠杆菌属）引起的乳内感染。然而，可以导致乳腺炎的病原体远远不止几种，依靠疫苗控制乳腺炎既不经济也不现实。目前国内对于乳腺炎的治疗大多还是采用抗生素，虽然在短期内控制了炎症的发展，但是从长远来看，大量使用抗生素治疗无异于饮鸩止渴。一方面，大量使用抗生素会催生耐药细菌的出现；另一方面，牛乳中抗生素的残留也会直接对消费者产生影响。因此，探寻一种有效的可以替代抗生素的治疗方法迫在眉睫。

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