猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus, PEDV）属于冠状病毒科α冠状病毒属，为单股正链RNA囊膜病毒。PEDV可引发不同年龄段的猪感染，主要致病症状为水样腹泻、呕吐导致的严重脱水。自2010年变异毒株的出现，该病对我国猪养殖业每年造成严重的经济损失。本研究将实验室从扬州某猪场分离冻存的PEDV YZ株病毒在非洲猿猴肾细胞（Vero细胞系）进行连续传代增殖培养，利用RT-PCR获得第5代、第20代、第40代的S基因、N基因和ORF3基因，克隆载体后进行测序，分析其遗传稳定性和与其他毒株同源性，并且构建基因进化树。测序结果表明PEDV YZ株是流行变异毒株，属于GⅡa亚群，且在不同代次间的遗传稳定性优良，同源性分析结果表明PEDV YZ株病毒与经典毒株CV777株的亲缘关系较远，与临床流行毒株关系较近。本研究为PEDV YZ株的生物学特性和PEDV分子流行病学研究奠定了基础。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法2
1.1实验材料 2
1.1.1 病毒毒株2
1.1.2 细胞2
1.1.3 主要试剂和耗材2
1.1.4 引物设计与合成3
1.2 实验方法3
1.2.1 细胞培养与病毒传代培养3
1.2.1.1 Vero细胞传代3
1.2.1.2 PEDV YZ株的传代培养和病变3
1.2.1.3病毒的收集和保存3
1.2.2 病毒基因的扩增4
1.2.2.1 病毒RNA提取4
1.2.2.2 病毒RTPCR扩增4
1.2.3 基因克隆4
1.2.3.1 病毒片段胶回收4
1.2.3.2 片段连接转化及菌液PCR鉴定4
1.2.4  *51今日免费论文网|www.jxszl.com +Q: *351916072* 
基因序列测定比对分析5
2 结果与分析5
2.1 Vero细胞的培养与病毒传代5
2.1.1 Vero细胞的培养 5
2.1.2 PEDV YZ株的传代培养及细胞病变观察5
2.2基因序列的测定及分析5
2.2.1 基因测序及拼接结果6
2.2.2 不同代次间基因的核苷酸遗传稳定性分析6
2.2.3 不同代次间基因的氨基酸酸遗传稳定性分析10
2.2.4 病毒核苷酸序列同源性分析11
2.2.5 病毒基因进化树分析13
3 讨论 16
致谢17
参考文献17
图1 细胞培养48h结果（200×） 5
图2 片段PCR结果 6
图3 S基因核苷酸遗传稳定性分析 8
图4 N基因核苷酸遗传稳定性分析 9
图5 ORF3基因核苷酸遗传稳定性分析9
图6 S基因氨基酸遗传稳定性分析10
图7 N基因氨基酸遗传稳定性分析11
图8 ORF3基因氨基酸遗传稳定性分析 11
图9 S基因核苷酸同源性分析12
图10 N基因核苷酸同源性分析13
图11 ORF3基因核苷酸同源性分析 13
图12 S基因进化树14
图13 N基因进化树15
图14 ORF3基因进化树 16
表1 S基因、N基因、ORF3基因引物设计3
表2 同源性分析毒株对照表12
猪流行性腹泻病毒YZ株的传代培养及遗传变异分析
引言
引言：猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus, PEDV）属于冠状病毒科α冠状病毒属，为单股正链RNA囊膜病毒。PEDV可引发不同年龄段的猪感染，主要致病症状为水样腹泻、呕吐导致严重脱水。每年猪流行性腹泻病对我国猪养殖业造成严重的经济损失，1971年，在英国首次发现了猪流行性腹泻。在1978年由Debouck [1]发现猪流性腹泻病毒，并命名为CV777株。随后很多国家相继报道，尤其是欧洲国家和亚洲国家。由于它传染了整个欧洲，人们把这种疾病命名为“流行性腹泻（EVD）。
自从1978年首次发现CV777株以来，研究者就发现PEDV病毒很难适应体外细胞培养，瑞士科学家Hofmannm[2]在1988年发现在添加胰酶的Vero细胞中，可以使PEDV在体外成功的培养。添加胰酶的作用主要是为了用胰酶切割PEDV的S蛋白[3]，可以使病毒更顺利的进入宿主细胞。PEDV在体外传代培养难度大，在传代培养中的滴度低，影响了PEDV的研究进度和其相关生物制品的研制。
PEDV的基因全长约为28kb，包括5端、3端非编码区及至少7个开放阅读框。其中5个开放阅读框编码主要的结构蛋白，包括纤突（S）蛋白、一种辅助蛋白ORF3、包膜（E）蛋白、膜（M）蛋白、核衣壳（N）蛋白[4]。S基因编码纤突蛋白，为病毒表面主要的糖蛋白，基于S蛋白的同源性可以将S蛋白分为S1段和S2段，S1段的突变性较高[5]，S2较为保守。在宿主细胞和S蛋白结合后，水解为S1蛋白和S2蛋白，通过此途径来促进病毒粒子和宿主细胞互作[6]。S基因是PEDV的重要毒力因子，S基因在不同毒株间的差异性较大，在流行毒株和经典毒株间会发生碱基的突变、插入和缺失。S蛋白可以作为研究当前流行毒株的疫苗的主要靶点[7]，因此对S基因的遗传稳定性分析、同源性分析、构建进化树等可以使我们更好的了解不同毒株间的亲缘性关系、遗传突变等等生物学信息。N基因编码核衣壳蛋白，为PEDV中最保守的结构蛋白[8]。在病毒感染宿主的初期，N蛋白会大量表达，所以N蛋白可以作为PEDV早期诊断的一个重要指标[9]。而且N蛋白具有良好的免疫原性，可介导宿主的细胞免疫、体液免疫[10]。ORF3基因编码PEDV中唯一的辅助蛋白，目前对其生物学功能研究较少。有研究表明辅助蛋白和冠状病毒的体外适应性有关，ORF3基因编码的辅助蛋白可以降低PEDV的体外适应性，ORF3基因的突变或者敲除可以使病毒更加适应病毒的传代培养[11]，所以ORF3可以作为区分PEDV野生毒株和人工培养的PEDV毒株的重要标志,ORF3基因可以作为病毒细胞培养中致病性减弱的标志[12]。此外ORF3基因和一种离子通道有关，其功能正在研究中[13]。

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