本研究于2018年从8个规模化猪场的64份病料中分离纯化到44株猪链球菌，采用CLSI推荐的微量肉汤稀释法测定了20种抗菌药物对分离株的最小抑菌浓度（MIC）并对耐药菌株携带的相关耐药基因进行了检测。结果显示，44株猪链球菌对大环内酯类、林可酰胺类以及多西环素的耐药率接近或已达到100%，显示出极高的耐药性；对喹诺酮类、酰胺醇类、氨基糖苷类、截短侧耳素类和β-内酰胺类（青霉素和阿莫西林）抗菌药呈中度耐药；但对头孢噻呋以及人用抗菌药（利福平、万古霉素和利奈唑胺）较敏感。本次所有分离株均为多重耐药菌，且发现其对大环内酯类、林可酰胺类和多西环素的耐药性共存。最后对分离株的大环内酯类、四环素类和截短侧耳素类抗生素的相关的16种耐药基因进行检测，此次分离菌株中仅检出耐药基因ermB、tetM、tetO和lsa(E)，检出率分别为95.45%、9.09%、59.09%和38.64%，进一步分析菌株的基因型与耐药表型高度一致。该研究不仅可以丰富猪链球菌耐药性监测数据，而且可为各猪场猪链球菌病的临床治疗提供用药参考，故具有重要意义。
目录
摘要2
关键词2
Abstract2
Key words2
引言2
1材料与方法3
1.1材料 3
1.1.1菌株来源3
1.1.2抗菌药物及主要试剂3
1.1.3 培养基4
1.1.4 主要耗材和仪器设备4
1.2方法 4
1.2.1 病料采集4
1.2.2 细菌分离4
1.2.3 细菌鉴定5
1.2.4药敏试验6
1.2.5耐药基因检测6
2结果与分析8
2.1细菌分离鉴定8
2.1.1菌落形态8
2.1.2 革兰氏染色镜检8
2.1.3 PCR鉴定8
2.1.4猪链球菌分离情况 9
2.2药敏试验结果9
2.3多重耐药分析11
2.4耐药基因 *51今日免费论文网|www.jxszl.com +Q: ￥351916072$ 
检测结果12
3讨论13
3.1猪链球菌的耐药性分析13
3.2耐药基因与耐药表型的关系13
3.3 猪链球菌病的防控13
致谢14
参考文献14
猪链球菌的耐药性调查及相关耐药基因检测
引言
猪链球菌病是一种危害较大的的人畜共患病，不仅给养猪业造成较大的经济损失，同时也严重危害人类健康。猪链球菌根据其荚膜多糖抗原的不同可分成33个血清型，目前从患病猪体内分离出的血清型以1型、2型、7型和9型为主[1]，其中2型作为致病力最强的血清型分布范围最广[2]。1998年，由2型猪链球菌引致的猪链球菌病在江苏爆发，造成大量猪死亡和相关从业人员感染发病。2005年，四川又爆发相似的猪链球菌病疫情[3]。
目前临床上治疗猪链球菌病的方式还是以抗生素治疗为主，但在生产养殖过程中，将抗生素作为饲料添加剂用于促进动物生长和预防细菌性疾病以及不合理的滥用，造成了该类细菌对各类抗菌药物产生不同情况的抗性[4]，且多重耐药现象在该类细菌中存在普遍，给猪链球菌的临床治疗带来了不小的挑战。杨建江等[5]对长春分离的22株猪链球菌进行药敏试验，结果显示，没有青霉素耐药株，克林霉素耐药率达到100%，80%以上的分离株表现出对大环内酯类药物、环丙沙星以及四环素耐药。杨春蕾等[6]检测了从天津地区分离到的11株2型猪链球菌的耐药性，发现所有分离株对9种临床常用抗生素均高度耐药，其中所有分离株对阿米卡星、四环素和多西环素均耐药，且所有2型猪链球菌均表现多重耐药，以9重耐药为主。
国外也存在许多对猪链球菌耐药性的报道。Marie等[7]分别检测了19962001年从法国病猪和不同国家病人体内分离到的135株猪链球菌对13种兽医临床常用抗菌药物的耐药情况，结果显示β内酰胺类、氟苯尼考、庆大霉素以及杆菌肽锌敏感率几乎达到100%，对多西环素、大环内酯类以及林可酰胺类抗生素耐药性较严重，仅有几株猪链球菌表现出对链霉素和卡那霉素耐药。Mrinalee等[8]检测了从印度临床健康携带者和患病猪中分离到的7株猪链球菌对17种抗菌药物的耐药性，发现大环内酯类以及庆大霉素耐药率为0，而对头孢氨苄，四环素和链霉素呈现较高的耐药率。进一步分析发现5株分离株表现出对4种及以上抗生素耐药，且耐药谱型各异。Marcelo等[9]检测了从巴西临床健康猪中分离到的260株猪链球菌对16种抗菌药物的耐药性，结果发现其对头孢类，氯霉素以及氟苯尼考耐药率较低，而对喹诺酮类、磺胺甲氧苄啶，四环素和克林霉素耐药率在60%100%。同时发现有99.61%的分离株为多重耐药菌。由此可见，猪链球菌的耐药现状已十分严峻，所以定期监测猪链球菌的耐药性变化可以在预防保健过程中根据猪场用药背景进行合理选择和轮换用药。
本研究收集了来自浙江省、江西省、福建省和江苏省8个规模化猪场的64份疑似猪链球菌病的病猪病料，进行猪链球菌的分离鉴定，测定20种抗菌药物对分离株的MIC值进而分析耐药性，同时检测分离株中大环内酯类、四环素类和截短侧耳素类的相关耐药基因。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株来源
本实验所用菌株分离自江苏省、浙江省、福建省和江西省的8个规模化猪场。金黄色葡萄球菌ATCC29213为质控菌株。
1.1.2 抗菌药物及主要试剂
青霉素、头孢噻呋、泰妙菌素购自上海源叶生物科技有限公司；阿莫西林购自珠海联邦制药股份有限公司；利福平、氟苯尼考、替米考星、多粘菌素、萘啶酮酸购自北京索莱宝科技有限公司；万古霉素、多西环素、沃尼妙林购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；利奈唑胺、恩诺沙星、麻保沙星、庆大霉素、红霉素、林可霉素、克林霉素、泰拉菌素、壮观霉素购自上海麦克林生化科技有限公司；氯霉素购自合肥新恩源生物科技有限公司。NaOH购于南京拓伦生物科技有限公司；革兰氏染色试剂盒、Gold view核酸染料、无菌1×TE缓冲液、50×TAE缓冲液购自北京索莱宝科技有限公司；2×Taq PCR Master Mix购自南京诺唯赞生物科技有限公司；DL1000 marker购自北京宝日医生物技术有限公司；1.1×T3 Super PCR Master Mix 、DL2000 marker、琼脂糖购自南京擎科生物科技有限公司。猪链球菌鉴定引物及耐药基因引物合成于南京擎科生物科技有限公司。
各药物和试剂配制方法如下：
1）药敏试验抗菌药储备液（2560 μg/mL）：用分析天平精密称取0.0256 g抗生素粉末，转移至10 mL EP管中，加入溶剂，完全溶解后转入容量瓶，用稀释液定容至10 mL。用0.22μm一次性滤器滤过除菌，分装保存于20℃。所有储备液应新鲜配制并保证无菌。

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