（目的）对从安徽某鹅场获得的星状病毒引起的患鹅组织病料分离到的毒株进行分离鉴定和动物回归试验，探索感染星状病毒后雏鹅的排毒情况。（方法）组织病料制成悬浮液过滤后经绒毛膜尿囊腔无菌接种13日龄鹅胚并盲传9代，通过PCR方法检测到鹅星状病毒的特异性基因片段，将其命名为AAStv/Goose/CHN/2018/AH，取稳定病毒代病毒接种1日龄雏鹅10只，同时设阴性对照组，于SPF隔离器中饲养观察48天，攻毒后48小时开始每2日采集一次咽喉及泄殖腔拭子进行RT-PCR检测。（结果）结果显示，感染病毒后，雏鹅于第二天开始出现发病症状并出现死亡，死亡只数递增，发病第8天之后逐渐恢复正常；RT-PCR检测病料发现，雏鹅自染毒后的第2天开始排毒，至第6天达到排毒高峰，第8天后排毒量逐渐减少，至14天之后不再排毒且无再次排毒现象；病理剖检发现，患鹅皮下、肝脏、肢关节及肾脏表面均有尿酸盐沉积，肾脏肿胀淤血。（结论）雏鹅感染星状病毒后，排毒周期约为14天，其间出现两个排毒高峰，分别为第6天和第8天，至14日后排毒停止。本试验分离到的毒株通过人工感染后产生与临床自然感染病例相同的症状和病理变化。
目录
摘要 1
关键词 1
Key words 1
1 材料与方法 2
1.1 试验材料 2
1.1.1 试验样品及动物 2
1.1.2 主要仪器设备及耗材 2
1.2试验方法 3
1.2.1 病毒分离 3
1.2.2 引物合成 3
1.2.3 分子生物学鉴定 4
1.2.4 星状病毒在雏鹅体内的排毒情况分析 4
2 结果与分析 5
2.1 细菌学检查 5
2.2 病毒分离培养与鉴定 5
2.2.1鹅胚死亡情况 5
2.2.2 患病鹅胚病理症状 6
2.2.3 RTPCR鉴定 6
2.3动物回归试验结果 7
2.4 攻毒感染鹅排毒试验结果 7
2.5 患鹅的剖检病理 8
3 讨论 9
参考文献 10
鹅星状病毒的分离鉴定及其在雏鹅体内的排毒情况
 *景先生毕设|www.jxszl.com +Q: #351916072# 
/> 引言
星状病毒（Astrovirus，AStV）属星状病毒科（Astroviridae）、星状病毒属中的无包膜、单股RNA病毒，宿主范围较广，包括哺乳动物、鸟类及水禽[13]。自1975年在人类暴发幼儿急性病毒性肠炎以来，星状病毒引起了相关学者的高度重视，同时也不断有新的星状病毒被发现的报道，如近年来出现的水禽的星状病毒[4]。2012年，国际病毒分类委员会（The International Committee on Taxonomy of viruses，ICTV）的最新分类报告指出，星状病毒科分为哺乳动物星状病毒属和禽星状病毒属[5]。研究资料显示，禽星状病毒属主要感染鸡、鸭及火鸡[6]。但自2017年以来，我国多个鹅场分别暴发了以痛风为主要特征的鹅的传染性疾病，该病主要发生于5 ~ 20日龄的雏鹅，患鹅的内脏器官及关节腔发生严重的尿酸盐沉积，死亡率可达50%，给鹅的养殖业造成了巨大的经济损失[7]。刘宁等人通过研究指出，该流行暴发可能与星状病毒密切相关。后来姜晓宁等的研究结果表明，导致雏鹅痛风病发生的病原为新型鹅星状病毒（Goose astrovirus，GoAStV）[7, 8]。徐荣等从患病雏鹅中分离出的AHL22017毒株与其他禽星状病毒具有很低的同源性，该毒株可在鹅胚和肾脏上皮细胞中复制，经过动物实验表明该病毒能引起血清中尿酸盐水平升高和肾脏尿酸盐沉积，表明新型鹅星状病毒是引起临床病例中观察到的导致雏鹅发生痛风的病原，进一步证明了雏鹅痛风病的病原为鹅源新型星状病毒[9, 10]。
Appleton和Higgins（1975年）通过电镜成功检测到星状病毒，此后电镜检测法也一直成为人门检测星状病毒的首选方法，已有研究者应用电镜研究并成功检测到新型的鹅星状病毒[11]。徐蓉、吕英军等等在其研究报告中显示，新型鹅源星状病毒能在鹅肾上皮细胞中进行复制、培养[12]。PCR作为一种新的分子生物学实验技术，在分子生物学研究和临床诊断上都发挥着极其重要的作用，该方法具有灵敏度高、快速特异、操作简单等优点[13]。因此，本研究拟通过自安徽某鹅场的患鹅组织中分离到的毒株进行动物回归试验，同时利用建立的RTPCR检测技术，对病料中鹅星状病毒在雏鹅体内的排毒情况进行动态观察和研究，为阐明GoAStV的致病机理和防控提供理论和实验依据。
1 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 试验样品及动物 采集来自安徽某鹅场的星状病毒感染患鹅的病变肾脏、肝脏、肺脏等组织样品、鹅星状病毒阳性对照样品均由天津瑞普生物技术股份有限公司生物制品研究院惠赠；试验用鹅蛋购自山东省某鹅场，运至天津瑞普生物技术股份有限公司空港基地实验动物中心的孵化器进行孵化；1日龄雏鹅购自南方某鹅场。
1.1.2 主要仪器设备及耗材 生物安全柜（NU4256000S型）为美国公司产品；超低温冰箱（EXF24086V型）为Thermo Scientific Revco公司产品；梯度PCR扩增仪（T100型）、凝胶成像分析系统（GELDOCXR+型）、全自动制冰机（N358）均为美国BIORAD公司产品；微型旋涡混合仪（XHOA）为江苏奉县实验室设备厂产品；电泳仪、水平电泳槽（DYY6D）为北京市六一仪器厂产品。
胰蛋白酶大豆琼脂（TSA）购自美国BD公司；50×TAE购自Biotopped公司；6×Loading Buffer、DL 1000 cDNA Marker、TakaRa MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit、PrimeScri TM II 1st Strand cDNA Synthesis Kit、PCR Kit、Ex Taq（R001B）均购自宝生物工程有限公司；Ex Taq酶、dNTP、DNA Marker DL 2 000、病毒基因组RNA/DNA提取试剂盒、一步RTPCR试剂盒均购自大连宝生物工程（大连）有限公司产品。
1.2 试验方法
1.2.1 病毒分离 无菌选取感染星状病毒的患病雏鹅的肝脏、肺脏、肾脏等组织，剪碎研磨后，用2倍提及的PBS稀释成匀浆，加入双抗灭菌处理后，反复冻融3次，于4℃离心机12000 rpm离心20 min，取上清液于20℃保存备用。无菌选取上清液，划线接种于TSA/2%FBS平板，置于烛缸内，37℃培养24 ~ 48 h，观察记录细菌生长情况。选取保存的上清液，于0.45微米的滤膜过滤后，经尿囊绒毛膜无菌接种于13日龄鹅胚，0.2 mL/胚，另取5枚鹅胚接种等量的PBS溶液作为对照组，共接种10枚鹅胚。37℃温箱孵育，每日照胚2次，弃去24小时内死亡鹅胚，死胚随时冻存，连续观察7 d，将死亡鹅胚全部放4℃过夜，次日无菌收取鹅胚及尿囊液并观察胚体变化。按照上述方法在13日龄的鹅胚上盲传9代，收集死亡胚体及其尿囊液。

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