本实验选用的实验材料为屠宰场母猪健康卵巢，猪卵巢从屠宰场获取，卵母细胞将从卵巢上的卵泡液中得到，卵母细胞培养至孵化后的囊胚后用于探究自制的囊胚的体外培养体系是否能促进孵化后囊胚的伸长，生长发育。实验结果得到的卵母细胞成熟率为71.95%，88.53%，70.2%，87.83%。孤雌激活技术可将卵母细胞重构成胚胎，之后培养成囊胚，获得的囊胚率分别为16.67%，15.15%，17.07%，16.36%。囊胚放入琼脂糖凝胶孔道内继续培养，制作琼脂糖凝胶是为囊胚在体外的生长发育提供物理孔道支持。实验结果观察到囊胚在琼脂糖孔道内并未看到继续伸长的迹象，可能是因为观察时长不够的原因所致。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法2
1.1材料2
1.1.1使用材料2
1.1.2溶液的制备及实验准备2
1.2研究方法3
1.2.1卵母细胞的采集处理与成熟培养3
1.2.2 MII期卵母细胞的处理3
1.2.3孤雌激活3
1.2.4制作琼脂糖凝胶孔道3
1.2.5囊胚的转移培养4
1.3实验设计4
1.4统计与分析4
2.结果与分析4
2.1 GV期卵母细胞体外培养至MII期的情况5
2.2制作琼脂糖凝胶的成功率6
2.3胚胎体外培养的囊胚率及囊胚放入琼脂糖凝胶孔道后的生长情况7
3.讨论8
3.1卵母细胞体外成熟的影响因素8
3.1.1卵泡液8
3.1.2 IVM培养液9
3.1.3激素9
3.1.4卵母细胞的采集方法9
3.2孤雌激活对卵母细胞发育成囊胚的影响9
3.3早期胚胎体外培养体系的影响10
致谢10
参考文献11
一种猪囊胚孵化后体外培养方法
引言
引言 卵母细胞由卵泡中破裂后排出进入输卵管与精子相遇并受精，沿着输卵管继续移动至子宫内壁，此 *景先生毕设|www.jxszl.com +Q: @351916072@ 
过程中胚胎不断发育，由受精卵发育成2细胞，4细胞，桑椹胚，囊胚。囊胚是卵子受精后经卵裂形成，具有内细胞团、外滋养层细胞以及囊胚腔而形成的胚胎[1]。囊胚运动至子宫内后需要与子宫建立联系[2]，过程中囊胚中的胚胎从透明带内孵出即为囊胚孵化。
在子宫内的一个特殊环境例如子宫内膜，合适的激素水平等使囊胚能够着床发育，但因为体外培养缺乏这些模拟子宫内的这些条件因而囊胚在体外的继续培养很难实现。目前囊胚孵化后的体外培养已经证明牛胚胎能够在体外环境下生长，可以达到内胚层的建立和滋养层的脱落[34]。但由于猪胚胎对外环境较敏感，且囊胚体外孵化效率低，即使能够体外孵化，之后胚胎也会因一些外因素的影响而导致死亡，故猪胚胎孵化后的体外培养方法还未被建立。而研究囊胚的体内的发育情况只能通过宰杀受精后母猪的方式，相对来说非常麻烦。因此若找到合适的囊胚体外培养方式不仅可以解决直接宰杀活猪的问题，也能进一步让人们在体外继续研究观察囊胚的生长发育机制。
猪卵母细胞通过体外受精、孤雌激活或体细胞核移植等方法可重构成胚胎，孤雌激活多采用电激活的方法，利用短时间的高电压直流电使卵母细胞内的Ga2+浓度发生变化，最后达到活化的效果。由于该技术对细胞的毒性小，活化效果好，且目前实验室内多配有电融合仪，细胞电激活的步骤简便了许多，故许多人会选择电激活的方法进行细胞的激活。目前已实现牛、羊、小鼠、猪、兔等动物的卵母细胞的电激活，然而该方法虽然较为普遍，但是仍然存在一些因素降低激活效率，影响着实验效果，例如电激活时的电压，及细胞在高压电场内的时间，电场方向，电激活液的种类等。卵母细胞孤雌激活后会重构成胚胎，早期胚胎在第5到7天能发育成囊胚，并从第七天开始陆续孵化出透明带，在体内孵化的胚胎会到达子宫并向子宫内膜深层迅速生长, 而此时子宫内膜上皮细胞也会不断的更新修复。这样囊胚就完全的植入了子宫内膜底部[5]。但是囊胚在机体内是如何破除子宫内膜上皮组织的机制并未清楚。因此为了更好的研究孵化后猪胚胎的发育机制，非常需要建立一种猪囊胚孵化后的体外培养方法。
本实验通过卵母细胞体外成熟培养技术，统计出卵母细胞的成熟率。孤雌激活获得的胚胎虽然不能发育成新个体，但是胚胎可发育至囊胚阶段[6]，统计出获得的囊胚率。制作琼脂糖凝胶孔道并统计制作成功效率，同时记录放入琼脂糖凝胶孔道的囊胚的生长形态，综合数据，观察琼脂糖凝胶孔道培养方法是否能为孵化后囊胚的体外培养提供伸长的物理支持。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 使用材料 选用的实验材料为屠宰场母猪健康卵巢，猪卵巢从屠宰场获取，立即装入含有青霉素和链霉素的37℃生理盐水保温瓶中，6~8小时内运送回实验室。细胞体外成熟培养液(IVM)，胎牛血清，双抗（链霉素和青霉素），T2（TCM199+2%胎牛血清），ASP（洗卵液），F+电激活液（0.3M 甘露醇，0.1mM 硫酸镁，0.05mM 氯化钙，0.01%（w/v）聚乙烯醇），PCC（化学激活液），PZM3（胚胎体外成熟培养液）其中IVM，T2,均为实验室配制。
1.1.2 溶液的制备及实验准备 IVM的配制：需要用卵泡液（PFF）与胎牛血清（FBS）制成IVM，配制过程用到庆大霉素，谷氨酰钠。IVM的配制过程为，将抽取的离心管上清液体吸出进行离心，3000r/min,5min，离心后下层沉淀为颗粒细胞和杂质。用移液枪吸取上清液进行第二次离心，6000r/min,5min，离心后的液体没有沉淀为宜，否则再次离心直至无沉淀。50ml离心管中加入20ml的TCM199；PMSG、HCG用TCM199稀释到1ml后，各加750μl到50ml离心管中；将谷氨酰钠加500μl到离心管中，再加入庆大霉素121μl；解冻后的PFF取5ml用0.22微米的过滤器过滤一次后加入离心管，再取5mlFBS加入离心管中；最后加入TCM199至离心管50ml刻度线。配制好后的离心管用封口膜密封，震动混匀，再用0.22微米的过滤器过滤一次。将过滤后的IVM分装到2ml离心管中，4°C温度下保存。

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