本实验拟从猪卵巢中完整分离健康、早期闭锁的3-5mm有腔卵泡，提取RNA并反转录获得cDNA，根据环状RNA分子circINHA设计引物并通过PCR验证，最后通过RT-qPCR检测分析circINHA在卵泡闭锁过程中的表达模式和特征，探索其在猪卵泡闭锁过程中的作用。本研究从表遗传的角度阐述circRNA介导调控的卵泡闭锁这一重要生命过程，是对卵泡闭锁调控机理的有益补充。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言（或绪论）1
1材料与方法2
1.1实验材料与试剂 2
1.1.1实验样品采集2
1.1.2主要试剂与仪器2
1.2实验方法2
1.2.1猪卵泡的分离与分类2
1.2.2总RNA提取3
1.2.3反转录cDNA的合成3
1.2.4 设计引物3
1.2.5聚合酶链反应(PCR)条件及产物分析4
1.2.6实时荧光定量PCR扩增（RTqPCR）4
1.2.7统计分析4
2结果与分析4
2.1健康卵泡和闭锁卵泡的分类4
2.2 circRNA的鉴定5
2.3 circINHA在猪健康和闭锁卵泡中的差异性表达6
3讨论 7
致谢7
参考文献7
图1 健康卵泡和早期闭锁卵泡的区分5
图2 circRNA引物设计5
图3 聚合酶链反应扩增的结果6
图4 NCBI比对结果16
图5 NCBI比对结果26
图6 circINHA 首尾链接序列测序峰图6
图7 circINHA在猪健康和闭锁卵泡中RTqPCR检测结果7
表1对基因进行PCR扩增所设计的引物4
环状circINHA在猪卵泡闭锁过程中表达特征分析
引言
雌性哺乳动物中，多数卵泡并不能发育成熟并排卵，它们在发育过程中退化，然后被清除体外，这称之为卵泡闭锁[1]。卵泡闭锁是一个正常的 *景先生毕设|www.jxszl.com +Q: *351916072* 
生理过程，发生在机体的各个阶段，但几乎所有卵泡最终都会闭锁，因此研究基因对于卵泡闭锁的调控机制有着重要意义。长久以来，人们一直在研究卵泡闭锁，但迄今为止，确切的调控卵泡闭锁的分子机制尚未阐明，仍然需要进一步的探索和研究。
卵泡闭锁严格意义上指卵泡未能排卵或者卵泡破裂[2]。由此我们把最终会消失的卵泡称为闭锁的卵泡。根据一些研究可以得出，卵泡在生长的初期会生长得非常缓慢，然而在卵泡腔形成之后的生长过程会变得非常迅速。有些研究表明，发生卵泡闭锁过程最多的是早期有腔卵泡，处在原始卵泡过程中的卵泡闭锁现象比较少见。卵泡在闭锁的过程中会出现的生物形态学特征有:卵母细胞的细胞核固缩，颗粒细胞脱离细胞层散落在细胞质中，胞质和染色体溶解，形成间质腺，以及闭锁小体的出现。
研究和阐明卵泡闭锁这一重要的繁殖学生理现象的分子机制将进一步完善和丰富繁殖学理论，为提高家畜的繁殖效果提供良好的理论基础。一般认为，卵泡细胞凋亡不利于卵母细胞获得减数分裂的能力[3]。我们设想可以通过抑制卵泡闭锁的过程，减少处于闭锁卵泡的数量，增加排卵数量，提高优良母畜繁殖数量及能力，提高养殖场的经济效益，并提供给胚胎工程研究更多的实验材料。但也有其它研究表明，卵泡闭锁也有可能对卵母细胞有利，轻度卵泡闭锁还可以使卵母细胞获得发育能力。卵母细胞的发育能力与卵泡闭锁息息相关，我们可以通过控制卵泡是否闭锁从而调控卵母细胞的发育。
研究和阐明卵泡闭锁这一重要的繁殖学生理现象的分子机制也可以为治疗某些与女性排卵相关的疾病提供理论与实验基础。虽然女性身体内的绝大部分卵泡最终都会发生闭锁，但是如果卵泡闭锁过程中闭锁卵泡的比例和出现闭锁的时间紊乱，就可能会导致一些生殖疾病的发生，例如：不孕不育、多囊卵巢综合征。由此可以推断，研究卵泡闭锁的分子机制可以为预防一些女性的生殖疾病提供理论基础。人们还设想，如果可以控制卵泡闭锁，就可以推迟女性绝经期的到来，延长女性的生育期。
环形RNA(circular RNA,circRNA)是一类非编码性RNA，广泛存在于各种生物体中的一种特殊的内源性RNA分子[4]。circRNA具有重要的生物学功能，例如可以调控基因的表达。circRNA具有细胞表达稳定性好且表达丰富等特点[5]，有非常重要的研究意义。抑制素(Inhibin, INH)是由猪睾丸支持细胞和卵巢颗粒细胞分泌的糖蛋白质激素，由一个α亚基和一个β亚基通过二硫键构成，其中抑制素α亚基(Inhibin α， INHA)在抑制素发挥生理功能中必不可少的[6]。在卵泡的发育和卵母的细胞成熟过程中抑制素充当着重要的角色。INHA基因是抑制素的功能中心，主要在动物卵巢、睾丸中表达，预示着INHA基因可能具有提高家畜排卵率的生殖潜力[7]。circINHA是在mRNA前体（premRNA)剪切过程中，外显子的5’端与3’端以反向剪切((backsplicing)形式形成3、5磷脂键连接的circRNA[8]。circRNA的研究还刚刚兴起，但其重要性已引起国内外学者的高度重视，它可能成为一种新型的生物标志物，具有广阔的应用潜力，为人们发现新的疾病预防和治疗方法以及新的靶向药物开启了一扇崭新的大门。
1 材料与方法
1．1 实验材料与试剂
1．1．1 实验样品采集
本实验所使用卵巢均来自商品长白母猪。在屠宰母猪后3 5 min内摘取产品长白母猪的双侧卵巢，带回试验室后继续进行后续试验[9]。在37℃条件下运输，且运输过程中将卵巢放置在含有抗生素的生理盐水中，防止细菌的污染。

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