生殖系是由两性配子、包括形成两性配子的所有前体细胞组成，负责将遗传信息传代给新一代个体的细胞家族。哺乳动物精原干细胞（spermatogonial stem cells，SSCs）是位于睾丸生精小管的基膜上，既能通过自我更新维持数量恒定，又能在体内定向分化形成精子的一类生殖系干细胞。P53基因是细胞内一种重要的抑癌基因，可调控干细胞的分化。研究发现P53在SSCs的发育分化过程中起重要作用。为了检验P53在小鼠生殖干细胞中的功能，本试验构建条件性敲除P53L/L:Ddx4-cre转基因小鼠，在生殖系特异性地敲除P53基因，结果显示，与对照组野生型小鼠相比，30日龄的P53L/L:Ddx4-cre小鼠睾丸中Plzf阳性细胞数量显著增加（p<0.05）；42日龄 P53L/L:Ddx4-cre小鼠睾丸中Plzf阳性细胞数量极显著增加(p<0.01)，表明在生殖系中特异性敲除P53基因，会导致精原干细胞的数量增加。
目录
摘要3
关键词3
Abstract3
Key words3引言3
1材料与方法5
1.1材料5
1.1.1 实验动物5
1.1.2 主要试剂5
1.1.3主要仪器5
1.1.4 引物合成5
1.2 方法5
1.2.1 小鼠模型构建5
1.2.2 小鼠DNA鉴定6
1.2.3 组织包埋 6
1.2.4 免疫组化实验7
1.2.5 Plzf阳性细胞计数7
2 结果与分析7
2.1 PCR鉴定结果7
2.2睾丸组织及IHC染色8
2.3 精原干细胞数量统计8
3 讨论10
3.1实验进展10
3.2前景展望11
致谢 11
参考文献 11
图1 8图2 9
图3 9
生殖系特异性P53敲除对小鼠睾丸精原干细胞的数量的影响研究
引言
P53基因是细胞内一种重要的抑癌基因，位于哺乳动物17号染色体的短臂上，由11个外显子和10个内含子构 *景先生毕设|www.jxszl.com +Q: &351916072& 
成，编码分子量为53kD的蛋白[1]。P53基因目前已被证实与动物机体细胞组织的生长、发育与分化等过程密切相关，并且主要在DNA修复、阻滞细胞周期、诱导细胞凋亡中发挥生物学功能[2]。David C. Corney等人发现P53蛋白是一种转录因子，在许多类型的人类癌症中经常发生突变。细胞应激，例如DNA损伤，缺氧或不适当的癌基因激活，激活并稳定P53会导致抗增殖反应，例如细胞周期停滞，细胞凋亡或衰老。P53通过结合DNA序列的两个重复可直接激活关键基因来协调这种反应。已知被P53激活的基因包括P21，Gadd45，Bax及其负调节因子Mdm2[3]。代晓丽等人也发现野生型P53是一种关键的转录调控因子，可以反式激活下游靶向基因的表达。突变型 P53不仅失去肿瘤抑制功能，还能获得新功能，例如获得负显性功能，抑制野生型P53的转录活性，诱导某些基因出现异常表达[4]。SsangTaek Lim等人发现P53激活诱导细胞周期停滞，核FAK通过促进P53的转化促进细胞增殖和存活的生物学作用[5]。魏辉等人发现P53通过抑制细胞活力及周期的重调节要因子Akt1的磷酸化水平，调控GSK3β表达，从而影响肿瘤干细胞的分裂与自我更新，抑制肿瘤的增殖，表明P53可以抑制干细胞的自我更新能力[6]。研究表明，P53基因可调控干细胞的分化，调节干细胞的自我更新。P53基因上调促进干细胞的分化，P53基因下调维持干细胞干性，抑制分化[7]。
生殖系（germline）或生殖细胞系（germ cell lineage），也称种质系或种质细胞系，起源于一小群原始生殖细胞（Primordial germ cells，PGCs），由两性配子还有形成两性配子的所有前体细胞（其中包含干细胞）组成，是可以产生新一代个体、传递遗传信息的一个特殊的细胞系[8]。
雄性动物生殖系干细胞被称为精原干细胞(spermatogonial stem cells，SSCs)，SSCs位于雄性动物睾丸曲细精管的基膜上，具有干细胞的基本特性，不仅可以通过自我更新能力维持恒定的数量，还可以在体内和体外信号的调控下增殖分化为各阶段的生殖细胞。PGCs在胚胎的发育过程中先迁移到生殖嵴，转化为性原细胞(gonocyte)，在个体出生后，性原细胞再进一步发育为包括SSCs在内的未分化精原细胞。单个型(A single，As)精原细胞通过自我更新或者分裂形成由两个胞质桥相连的对称型(A paired， Apr)精原细胞。Apr进一步分裂形成由4、8、16个细胞相连并排列成串的链状排列型(A aligned， Aal)精原细胞。Aal经过连续6次的细胞分裂，依次产生A2、A3、A4、In等中间型和B型精原细胞。B型精原细胞再多次分裂，体积增大并分化形成初级精母细胞，最终经过减数分裂和变形成为成熟的长型精子[9]。精原干细胞能够进行冷冻保存、体外培养、遗传修饰及同种、异种移植，SSCs是揭开精子发生机理的重点目标。精原干细胞自我更新和分化能力的受损，直接影响雄性个体睾丸生殖功能，导致不育。
Mito KanatsuShinohara等人发现P53参与精原细胞相关基因的调控，如Kit或Fas，而P53或Fas的缺失可以挽救Kit突变小鼠的生精功能衰竭，表明P53或Fas基因可能参与精原干细胞的质量控制[10]。吴崇洋等人研究发现，白藜芦醇干预白消安引起的小鼠无精症状是通过抑制P53基因的表达，从而保护SSCs的功能并促进其增殖[11]。还有研究表明，P53蛋白可以抑制精原干细胞重要因子Plzf的转录活性，从而导致精原干细胞数目的减少[12]。Teresa A.Lehman等人发现，P53参与控制细胞增殖，P53突变和野生型等位基因丢失使啮齿动物细胞永生化[13]。Kei Ishii等人发现P53缺失增加了辐射后SSCs的存活率，精原细胞数量的减少是由分化精原细胞中P53依赖性细胞凋亡引起的[14]。因此推测P53在生殖系统基因调控中对精原干细胞的数量可能起到了非常重要的影响。

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