白藜芦醇对免疫应激小鼠肠道结构形态和抗氧化功能的影响【字数：8672】
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法2
1.1 动物分组及日粮 2
1.2 样品采集 2
1.3 测定指标及方法2
1.3.1 肠道结构形态观察2
1.3.2 抗氧化功能指标分析2
1.3.3 mRNA分子水平指标2
1.4 数据分析方法3
1.5 技术路线3
2 结果与分析 4
2.1 空肠与回肠结构形态4
2.2 肠道结构形态各项指标5
2.3 肠道抗氧化指标分析6
2.4 相关mRNA表达7
3 讨论7
4 结论10
致谢10
参考文献10
白藜芦醇对免疫应激小鼠肠道结构形态和抗氧化功能的影响
引言
引言
免疫应激是指动物受到能诱发免疫反应的病原和非病原因素刺激时所出现的一系列神经内分泌反应以及由此而引起的各种功能和代谢的改变。
白藜芦醇（resveratrol）是存在于水果、中药和葡萄酒中的一种植物抗毒素，具有多种多 *51今日免费论文网|www.jxszl.com +Q: ￥351916072￥
样的生物学作用。对白藜芦醇生理功能的认识源于 WHO主持的世界心血管疾病控制系统这项流行病学调查。并且白藜芦醇具有广泛的生物学活性，如抗癌、抗动脉粥样硬化、抗凝血、抗氧化、抗菌、免疫调节及神经保护等【1】。然而，对于白藜芦醇这一新型的抗免疫应激添加剂的了解还不够，需要进行多项实验研究来验证其具有的生物学功能以及对于临床治疗与制药的可行性来用于治疗现代世界所流行的部分疾病。因此，通过小鼠模型进行实验研究作为临床的基础是十分有必要的。
1 材料与方法
1．1 动物分组及日粮
所有程序均按照中国动物福利和实验方案指南进行，并经大学机构动物护理和使用委员会（NJAUCAST2015095）批准。从扬州实验动物研究所（SCXK（Su）20120004）购买60只C57BL / 6J雄性小鼠（6周龄），将所有小鼠圈养在环境控制室（25.0±0.5℃）每日光照12小时，黑暗12小时允许随意饮用饲料和水。在本实验中，我们科学地采用完全随机化试验设计，并进行为期6周的正式试验。在本实验中，我们采用60只体重相近的雄性c57BL/6J小鼠，并将它们随机分为四组，每组的重复数为3，每个重复为5只小鼠。在适应两周后，将小鼠随机分组，分组如下：重复PBS注射+对照饮食（CON），重复LPS注射+对照饮食（LPS），重复LPS注射+ 100mg / kg白藜芦醇补充饮食（LRL），重复注射LPS + 500mg / kg白藜芦醇补充饮食（LRH），实验期为6周。每次处理有三个重复，每个重复五只小鼠。本研究中的每只小鼠腹腔注射500μg/ kg体重的PBS或LPS，LPS的剂量通过我们的预实验确定。此外，每两天记录采食量，每周末记录体重。
本研究中使用的白藜芦醇和LPS购自SigmaAldrich：Resveratrol（V9003865G，≥98％），来自大肠杆菌O111：B4的脂多糖（L4130100MG）。所有饮食均由Trophic Animal Feed HighTech Co.，Ltd。（Natong，China）提供。
1．2 样品采集
在试验第6周，将小鼠称重后乙醚麻醉，眼窝取血后处死，在幽门和盲肠之间完整地取下小肠，盲肠前1cm的肠段固定为回肠，小肠正中1cm为空肠，用预冷的PBS对小肠冲洗以除去内容物，于4%多聚甲醛固定。剩余肠段按空肠和回肠保存于无菌冻存管，于80℃冻存。血样于4℃下4000rpm离心10分钟，收集上清分装并保存于80℃待用。
3 测定指标与方法
3. 1 肠道结构形态观察 采用苏木素伊红染色观察肠道形态。简单的步骤为：取出在多聚甲醛中固定24h的空肠和回肠，经修块，梯度酒精脱水，二甲苯透明，浸蜡，包埋仪包埋，切片(厚度5(m)处理后，对切片进行苏木素伊红染色，在100倍和200倍显微镜下观察切片并拍照。
3. 2 抗氧化功能指标分析 所有试剂盒均依照Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute的说明书进行操作。肠道超氧化物歧化酶(SOD)的测定方法为羟胺法；利用DTNB的循环反应，测定组织和体液中的总谷胱甘肽和氧化型谷胱甘肽（GSSG）的含量；酶促反应速度表示谷胱甘肽过氧化物酶（GSHPX）的活力；TBA法测定脂质过氧化物丙二醛（MDA）的含量。
1. 3. 3 mRNA分子水平指标 使用实时荧光定量PCR测定，按照反转录试剂盒说明书的方法和步骤进行测定【2】。反转录PCR (reverse transcription PCR,RTPCR),是指以mRNA为模板 在反转录酶作用下合成的cDNA 第一链的PCR【3】。该反应分为两步，第一步在单引物的介导和反转录酶的催化下合成RNA 的互补链cDNA； 第二步加热后cDNA 与RNA 链解离，然后与另一引物退火，并由DNA 聚合酶催化引物延伸生成双链DNA，最后同常规PCR一样，扩增靶DNA。合成cDNA 第一链所用的反转录酶是一类依赖于RNA 的DNA 聚合酶。目前常用的反转录酶主要有两种：一种是来源于禽成髓细胞性白血病病毒(avian myeloblastosis virus,AMV)的AMV 反转录酶，另一种是来源于莫洛尼鼠白血病病毒(moloney murine leukemia virus,MoMLV) 的MOMLV 反转录酶【4】。提取肠道组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo(dT)或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。再以cDNA为模板进行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因表达。PCR的构建【5】（1）取0.5ml PCR管，依次加入下列试剂：第一链cDNA 2μl，上游引物（10pM），2μl 下游引物（10pM），2μl dNTP(2mM)，4μl 10×PCR buffer，5μl Taq 酶（2u/μl）1μl（2）加入适量的ddH2O，使总体积达50μl。轻轻混匀，离心。（3）设定PCR程序。在适当的温度参数下扩增2832个循环。为了保证实验结果的可靠与准确，可在PCR扩增目的基因时，加入一对内参（如G3PD）的特异性引物，同时扩增内参DNA，作为对照。（4）电泳鉴定：行琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察结果。（5）密度扫描、结果分析：采用凝胶图像分析系统，对电泳条带进行密度扫描。实时荧光定量PCR：realtime quantitative PCR技术是指在PCR反应体系中加入荧光基团，通过荧光信号不断累积而实现实时监测PCR全程，然后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。应用实时定量PCR技术可以对基因时间、空间表达水平差异进行比较。
原文链接：http://www.jxszl.com/yxlw/dwyx/562420.html
