研究苯丙氨酸对猪胃CaSR基因的表达和胃窦胃肠激素（SS和Gastrin）分泌的影响。采集猪胃窦组织样品，建立表面灌流系统，分别用不同浓度的苯丙氨酸、CaSR激动剂cinacalcet、CaSR抑制剂NPS2143对胃窦组织灌流，收集灌流液和组织，利用酶联免疫吸附法测定SS和Gastrin的浓度，并检测CaSR基因的相对表达。结果显示，添加80mM Phe或CaSR激动剂cinacalcet时 SS和Gastrin的分泌量显著升高，同时 CaSR基因的表达量也显著增加（P<0.05）; CaSR抑制剂NPS2143显著抑制SS和Gastrin的分泌，显著下调CaSR基因的表达（P<0.05）。表明，Phe通过激活CaSR对猪SS和Gastrin的分泌有促进作用。
目录
摘要3
关键词3
Abstract3
Key words3
引言3
1材料与方法4
1.1建立灌流系统 4
1.2样品采集与处理 5
1.3试验设计5
1.3.1灌流实验5
1.3.2实验处理5
1.4.测定指标及方法5
1.4.1胃窦组织胃肠激素浓度5
1.4.2 CaSR基因相对表达量5
1.4.3逆转录反应（RTPCR） 6
1.4.4 实时荧光定量PCR（Realtime PCR）6
1.5数据统计与分析6
2结果与分析6
2.1 Phe对猪胃SS、gastrin分泌的影响7
2.2 CaSR激动剂对Phe诱导的猪SS、gastrin分泌的影响7
2.3 CaSR抑制剂对Phe诱导的猪SS、gastrin分泌的影响7
2.4不同处理对CaSR基因表达的影响8
3讨论8
致谢8
参考文献8
CaSR介导苯丙氨酸诱导猪胃窦胃肠激素分泌的规律
引言
胃肠道不仅可以消化和吸收营养物质，还能分泌和各种胃肠激素，对维持机体的消化功能和稳态有重要作用。胃肠道广泛分布多种内分泌细胞，包括胃壁细胞、D 细胞及胃窦G *景先生毕设|www.jxszl.com +Q: *351916072* 
细胞等［1］，这些内分泌细胞可以表达多种营养素感应受体[2]，通过感应糖类、及氨基酸、脂肪酸及肽类来调控各种胃肠激素的分泌，进而影响胃肠道的消化和吸收功能[3]。
胃泌素也叫促胰液素，是人类最早发现的激素之一，也是第一个被纯化的胃肠激素，1905年被伦敦大学Edlkins首次发现并命名，之后被证实为多肽，是胃泌素家族的主要成员[114]。胃泌素由分布于胃窦和十二指肠近端的G细胞所分泌，与肠嗜铬样细胞（ECL）上特异性受体即胆囊收缩素B受体（CCKB）结合后，作用于组胺脱羧酶，刺激ECL细胞合成和释放组胺，介导对壁细胞胃酸分泌的调节[5]。在人和大鼠的胃中，胃泌素分泌细胞（G细胞）中表达的CaSR通过PLC信号通路来调控胃泌素的分泌[6]。
生长抑素(somatostatin，简称SS或SST)，又叫生长激素释放抑制因子( somatotropin releaseinhibiting factor，简称 SRIF)，是一种由14个氨基酸组成的环状多肽。SS最初由绵羊下丘脑中分离得到，因具有抑制垂体生长激素( growth hormone，GH)分泌的功能而得名［7］。SS在机体内分布广泛，除下丘脑外，在中枢神经系统、外周神经元胃肠道以及胰岛中均有表达，在5种G蛋白偶联受体介导下参与了神经调节、激素分泌、胃肠道功能、免疫应答、细胞生长等多种生理过程。另外，SS具有抑制胃酸、胃泌素及蛋白酶分泌的作用[8]。
钙敏感受体(calciumsensing receptor，CaSR)是G蛋白偶联受体(GPCRs)C家族的成员，其在神经系统、心血管系统、胃肠道、肾脏及骨组织中分布广泛，当CaSR与激动剂及变构调节剂结合后，激活下游相关信号通路，对机体维持钙的稳态、细胞的增殖分化、免疫以及多种内分泌激素的分泌具有重要调节作用。研究发现机体内的Ca2+可以作为CaSR的天然内源性配体，具有细胞外第一信使的作用[911]。当Ca2+等激活剂与CaSR结合后，可激活CaSR，启动相关信号通路，调控细胞增殖、分化以及多种激素的分泌。研究表明，CaSR基因在人、大鼠和小鼠整个胃肠道中都有表达[12]，能感应多种氨基酸和多肽等[1314]。
目前关于蛋白质和氨基酸对胃肠中CaSR基因的表达及功能影响的研究主要来自于牛、人、鼠等，对猪的研究还比较少，对机体各项生命活动的调控作用也不明确。本课题设计了不同浓度梯度的苯丙氨酸（Phe），通过猪的离体胃窦组织进行灌流，测定不同浓度Phe下胃泌素和生长抑素的分泌规律和CaSR基因的表达，揭示CaSR在Phe诱导胃窦胃肠激素分泌中的作用，为以后研究CaSR调节动物生理活动的机制及发挥的生理功能奠定理论基础。
1 材料与方法
1．1 建立灌流系统 参考谈寅飞[15]的方法搭建灌流系统，由氧气瓶、贮液瓶、恒流泵、灌流小室、水浴锅、收集器及各种导管组成（图1），灌流小室由2.5ml一次性注射器改装而来（图2）。
图1：灌流系统 Superfusion system
1.氧气瓶 Oxygen pump; 2.细菌滤器 Bacteria colander; 3.贮液瓶 Media reservoir; 4.冰水浴 Ice
water bath; 5.恒流泵 Peristaltic pump; 6.灌流小室 Chamber; 7.玻璃管 Glass tube; 8.水浴锅 Water bath; 9.收集器 Collector.
1.针头 Needle; 2.橡皮塞 Rubber stopper; 3.尼龙网 Nylon filter platform; 4.注射器内腔 Syringe
1. 2 样品采集与处理 试验猪处死后立即取出整个消化道，取出胃组织，在冰上剪取胃窦组织，在磷酸缓冲液（PBS）中漂去内容物后放入液氮中保存，用于CaSR基因相对表达量以及胃泌素（Gastrin）和生长抑素（SS）浓度的测定。
1. 3 试验设计
1.3.1 灌流实验 猪颈静脉放血处死后迅速取出猪的胃组织（经PBS保存），清洗后剪切成约1mm2大小的组织块，随机分组后称重，置于灌流小室中，每个灌流小室400mg，用培养液（不含Phe的Kreb’s液，并通入含有5% CO2的O2）以6ml/h的速度进行预灌流。30min后用刺激液进行灌流，每20min收集一次，一共收集120分钟。灌流结束后，将收集的灌流液和胃窦组织块分别置于20℃和液氮中保存，待后续指标测定。

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