奶牛乳房炎致病菌多重实时荧光pcr检测方法的建立
目录
摘要3
关键词3
Abstract3
Key words 3
引言（或绪论）3
1 材料与方法4
1.1 试验菌株 4
1.2 主要仪器和试剂 4
1.3 引物与探针设计 4
1.4 阳性克隆质粒 5
1.5 临床样品 5
1.6 核酸提取的方法 5
1.7 荧光PCR体系的建立 5
1.7.1 实验原理 5
1.7.2 反应体系及反应条件 5
1.7.3 特异性检验 6
1.7.4 重复性实验 6
1.7.5 标准曲线的建立和敏感性实验 6
1.7.6 模拟临床样本的检测 6
1.7.7 临床样本的检测 6
2 结果 6
2.1 多重荧光PCR体系的优化11
2.1.1 最佳引物浓度的确定11
2.2.2 最佳探针浓度的确定12
2.2 荧光PCR特异性检验 6
2.3 荧光PCR重复性检验 7
2.4 荧光PCR敏感性实验和标准曲线的建立 8
2.5 模拟阳性样本 *景先生毕设|www.jxszl.com +Q: ^351916072^
的检测 9
2.6 临床样品的检测结果10
3 讨论 11
3.1 多重荧光PCR在奶牛乳房炎诊断上的应用前景11
3.2 体系优化实验的结果分析13
3.3 模拟样本和临床样本的检测的讨论13
致谢 14
参考文献 14
奶牛乳房炎致病菌多重实时荧光PCR检测方法的建立
引言
奶牛乳房炎是指奶牛乳腺组织受到微生物感染、机械损伤、热损伤和化学物品刺激而引起的一种炎症[1]，是奶牛养殖业中最常见的感染性疾病之一，不但引起产奶量和乳品质量下降,给奶牛养殖业带来巨大的经济损失，而且会给食品安全带来隐患，甚至危害人体健康[2]。研究表明引起奶牛乳房炎的病原微生物多达150多种，但临床上常见的病原菌则以金黄色葡萄球菌，链球菌和大肠杆菌为主，他们占总致病菌的80%~90%[34]。乳房炎。但由于我国奶牛临床型乳房炎发病率在9.7%55..6%，而隐形乳房炎发病率却高达 61.03% 79.62%[5]。所以，大多数乳房炎是亚临床型的，其临床症状和病原体诊断都不明确，所以无法制定有效的预防和控制措施。因此，如何早期发现奶牛乳房炎的发生，确定病原菌的类型以及采取有效的措施，就成了畜牧和食品安全行业关注的重点，这就为病原体的快速、特异性检测提出了迫切的要求。
可是，我国奶牛乳房炎的传统检测手段主要有CMT（加州乳房炎实验法），4%氢氧化钠凝乳法，以及有基于体细胞计数的奶牛隐性乳房炎快速诊断[6]。但他们都不能追踪病原菌的种类和相对数目。而奶牛乳房炎主要病原菌的多重荧光PCR检测方式的成立能迅速、快捷、灵敏的、特异的检测奶牛乳房炎3种主要致病菌，完成大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和链球菌的同时检测，从而实现一管多检，为致病菌检测供给一种更加实用的检测手段，这对及时有效控制病原菌传布途径，提高奶牛乳房炎的诊断效率和治愈率，并明确病原菌在奶牛群中分布的分子流行病学，以及提高我国乳品质量安全何保障人民身体健康具有重要的意义。为此，本研究分别根据三种主要致病菌的保守序列设计了特异性上下游引物，以及标记了不同荧光基团的探针，建立了引起奶牛乳房炎的主要病原菌的多重实时PCR检测方法。
1材料与方法
1.1试验菌株
金黄色葡萄球标准菌株（CMCC26001，CMCC26003）和多种金葡球菌的临床菌株，大肠杆菌(CMCC35666，ATCC44102)和多种的大肠杆菌临床株，无乳链球菌（CMCC12403），非阳性菌对照标准菌停乳链球菌，沙门菌，肺克菌，衣克次体。
1.2主要仪器和试剂
采用全自动荧光定量仪LightCycler 480 RealTime PCR Systems、Takaba公司的 probe qPCR试剂盒、Takaba公司的free water、Takaba公司的DNA试剂抽提盒。
1.3引物与探针设计
从Genebank分别拷贝若干条大肠杆菌，金黄色葡萄球菌， 无乳链球菌的基因序列，使用MEGA5.0软件进行基因序列比对，根据三种细菌高保守区域，选择软件的最优方案，分别进行上下游引物和Taqman探针的设计。在PrimerPremier 5.0系统中对引物和探针的详细序列分别进行对比研究，以及在NCBI中进行BLAST探究分析，确定引物和探针的序列具有高度特异性。擎科引物公司进行扩增三种主要病原菌的引物和探针序列的制作，（见表1）。
表1：实时荧光PCR扩增引物和探针
Table 1: Realtime fluorescence PCR amplification primers and probes
细菌
引物和探针名称
原文链接：http://www.jxszl.com/yxlw/dwyx/57469.html
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