牛冠状病毒（BCoV）是引起成年牛冬季痢疾、牛群肠道及呼吸道感染的重要病原[1]。近年来，奶牛、肉牛养殖业发展迅速，兽医相关技术人员紧缺，牧场饲养管理水平良莠不齐，犊牛呼吸道疾病综合征频发，疫病病原学的调查意义重大。本研究拟开展对牛冠状病毒的检测和流行病学分析，通过提取病毒基因组、RT-PCR方法对2017年7月~8月来自14个省份29个规模化牧场176份犊牛血清和鼻咽拭子混合样品进行BCoV阳性检测，初步调查BCoV的感染率，BCoV阳性样本数为38份，BCoV阳性率为21.59%（38/176）。通过对呼吸道疾病综合征发病地区、临床症状与其发生率的调查，得出如下结论从样品采集地区分析，黑龙江地区病料中冠状病毒的分离率最高，新疆地区次之，山西、上海、安徽未检出BCoV阳性样品；从呼吸道疾病相关症状发生率与BCoV阳性率分析，BCoV潜伏感染可能性较大，感染后通常呈亚临床症状，饲养管理人员难以检出阳性感染牛，BCoV难以根除和净化；从呼吸道疾病综合征症状分析，与腹泻症状相比，病畜的发热、鼻腔分泌物性状改变和感染冠状病毒的相关性较大。在国内，首次将犊牛冠状病毒感染与呼吸道疾病综合征症状相结合，进行流行病学分析。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
引言 2
1 材料与方法 2
1.1 材料 2
1.1.1 实验材料 2
1.1.2 检测试剂盒 2
1.1.3 设备 2
1.2 方法 2
1.2.1 样品处理 2
1.2.2 引物的设计与合成 2
1.2.3 总RNA的提取 2
1.2.4 反转录cDNA的合成 3
1.2.5 目的基因扩增 4
1.2.6 琼脂糖凝胶成像 4
2 结果与分析 4
2.1 采样地区 4
2.2 BCoV检测结果分析 5
2.3 各地区呼吸道疾病综合征发病情况 5
2.4 BCoV阳性样品临床症状分析 6
3 讨论 7
致谢 8
参考文献 9 *景先生毕设|www.jxszl.com +Q: #351916072# 

犊牛呼吸道综合征中牛冠状病毒感染的流行病学调查
引言
牛冠状病毒（BCoV）属于冠状病毒科乙型冠状病毒属a亚群，病毒颗粒为球状，囊膜上有纤突，核衣壳螺旋状对称，是线状正链单股RNA病毒，是导致犊牛腹泻仅次于轮状病毒的重要病原[2]。最近研究[3]发现，感染肺部的病原体，BCoV仅次于牛疱疹病毒。由BCoV引起的犊牛呼吸道疾病通常表现为亚临床型，多见于12~16周龄犊牛，可出现轻度呼吸道症状，如鼻炎、咳嗽和喷嚏，也可侵害下呼吸道[4]。该病毒是在肠道上皮及上呼吸道上皮内复制的一种环境性病原[5]，饲养管理不当、严寒湿润、应激等因素可促使BCoV感染，常呈地方流行性，发病过的牛场几年内可连续感染[6]，临床上难以净化。
我国BCoV研究起步较晚，其流行病学报道相对国外较少，1990年，姚火春等[7]对北京、安徽、南京等地6个奶牛场进行血清学检测，BCoV抗体阳性率高达80.2%。沈付娆等[8]对2013~2014年山东、天津、河南、河北5个牛场采集的107份鼻拭子检测发现BCoV阳性率为0~8.70%。BCoV感染在我国持续存在，尚无有效的预防治疗措施，养殖动物BCoV的检测和筛查对预防和净化由冠状病毒感染导致的呼吸道疾病综合征等流行病有重要意义。
有关牛呼吸道疾病综合征与牛冠状病毒的相关记载中发现，国外的研究都建立在BCoV是引起犊牛腹泻重要病原的基础上，BCoV在呼吸道疾病中的重要角色并未引起重视，国内BCoV病原学检测在犊牛呼吸道疾病综合征的流行病学调查中未见报道。近年来，针对呼吸道疾病综合征主要病毒性病原的疫苗已有生产研发[6]，并运用于临床预防，效果显著。而BCoV感染引发的呼吸道疾病综合征为牧场带来了极大的经济损失，其主要原因是对该病毒不了解、不重视。本研究结合犊牛呼吸道疾病临床症状与实验室检测结果，分析疾病临床表征与结果的相关性，为犊牛病毒性呼吸道疾病综合征的防控提供参考。
1 材料与方法
1．1 材料
1．1．1 实验材料 2017年7月~8月新疆、内蒙古、北京、辽宁、江苏、上海、安徽、广东、山东、河北、山西、甘肃、贵州、山西14个省份29个主要规模化牧场疑似有呼吸道疾病症状的犊牛群采集176份鼻咽拭子和血清样品，临床表现为发热、咳嗽、眼鼻分泌物异常、耳部异常活动、粪便异常等症状。无菌采集176份牛抗凝血并吸取上层血清，消毒棉签深入鼻腔及咽部采集分泌物，低温保存并送往实验室检测。
1．1．2 检测试剂盒 Biomiga EZgene Blood Viral DNA/RAN Miniprep Kit、HiScript II 1st Strand cDNA Syntheses Kit、1 mL EP管、八联管、TIP头均购自Vazyme公司。
1．1．3 设备 离心机、20℃冰箱、恒温水浴锅、PCR仪、琼脂糖凝胶、电泳槽、移液器等均为实验室所有。
1．2 方法
1．2．1 样品处理 取血清样品200 μL与鼻咽拭子样品200 μL均匀混合后反复冻融三次以上，取200 μL混合液进行BCoV检测。
1．2．2 引物的设计与合成 用Primer 5.0 软件自行设计引物，引物由GenScript公司合成，引物序列、退火温度及目的片段大小见表1。
表1 病毒检测PCR反应引物及目的片段大小
引物名称
核苷酸数
引物序列（5’3’）
退火温度（℃）
目的片段大小（bp）
BCoV[9]
F：nt 504~521
R：nt 940~957
F：CGATGAGGCTATTCCGAC
R：TGTGGGTGCGAGTTCTGC
55
453 bp
1．2．3 总RNA的提取
（1）实验前，在Buffer PLY内添加1%体积（以Buffer PLY体积计算）β巯基乙醇，4℃保存待用；Wash Buffer内添加60 mL浓度为100%的酒精，室温保存；Buffer PHB内添加20 mL浓度为100%的酒精，室温保存；RNA carrier内添加288 μL DEPC水，充分振荡溶解，20℃保存，反复冻融不超过三次。

原文链接：http://www.jxszl.com/yxlw/dwyx/57491.html