犬细小病毒病（Canine parvovirus disease，CPVD）是由犬细小病毒（Canine parvovirus，CPV）引起的病毒性传染性疾病，主要症状为出血性肠炎和心肌炎，是影响我国养犬业发展的重大传染病之一。本实验将用纯化的CPV免疫BALB/c小鼠，取其脾细胞，与无限增殖的SP2/0骨髓瘤细胞在HAT培养基中进行细胞融合，通过间接ELISA检测法检测并筛选出效价高的阳性细胞进行克隆，得到需要的杂交瘤细胞株，通过注射小鼠腹腔获得高效价的单克隆抗体。本实验共获得两株稳定分泌CPV单克隆抗体的杂交瘤细胞株，分别命名为3E2和5A7，其抗体亚类分别为IgG2bκ和IgG1κ，具有良好的反应性和特异性，其中3E2株单克隆抗体具有很好的中和活性。
目录
摘要 3
关键词 3
Abstract 3
Key words 3
引言 3
1.材料与方法 4
1.1主要材料 4
1.1.1 细胞、病毒、动物 4
1.1.2主要试剂 4
1.1.3 主要仪器设备 4
1.2制备方法 4
1.2.1 CPV的纯化 4
1.2.2 动物免疫 4
1.2.3 饲养细胞的制备 4
1.2.4 细胞融合 5
1.2.5 间接ELISA方法的建立 5
1.2.6 杂交瘤细胞的筛选 5
1.2.7 杂交瘤细胞的亚克隆 5
1.2.8 单克隆抗体腹水的制备 6
1.2.9 单克隆抗体效价测定 6
1.2.10 单克隆亚类鉴定 6
1.2.11 单克隆抗体特异性鉴定 6
1.2.12 单克隆抗体中和活性鉴定 7
1.2.13 杂交瘤细胞稳定性检测 7
2.实验结果 7
2.1细胞纯化结果 7
2.2间接ELISA的建立 7
2.3杂交瘤细胞株的建立 7
2.4单克隆抗体效价测定 7
2.5单克隆抗体亚类鉴定 7
2.6单克隆抗体特异性鉴定 8
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/> 2.6.1与CPV的反应性试验 8
2.6.2 与其他病毒的交叉反应性 8
2.7单克隆抗体中和活性测定 8
2.8杂交瘤细胞株的稳定性测定 8
3.讨论 9
致谢 9
参考文献 10
犬细小病毒单克隆抗体的制备
引言
引言
犬细小病毒病（Canine parvovirus disease，CPVD）是由犬细小病毒（Canine parvovirus，CPV）引起的病毒性传染性疾病。该病发病率高，死亡率高，主要症状为出血性肠炎和心肌炎[1]。90日龄以内的幼犬受到感染后会出现剧烈呕吐、排出酱油色稀便等出血性肠炎症状并伴有强烈腥臭味，严重者会引起心肌炎导致突然死亡[2]，成年犬死亡率稍低，但会出现长期带毒的现象[3]。该病全年可能发生，尤其在冬春相对寒冷的季节，常呈爆发性流行。病犬是主要的传染源，健康犬通过与病犬直接接触感染或摄入被污染的食物和水经过消化道间接感染。在我国，徐汉坤等在1983年正式确认本病的流行[4]。
CPVD是影响我国畜牧业发展的重大传染病之一。该病目前无特效药物治疗，主要通过免疫接种和改善饲养环境来进行预防。CPV单克隆抗体具有效价高、特异性强、血清交叉反应少、易于工业化生产和便于质量控制等优点，可以通过淋巴和血液循环系统快速到达被感染的组织器官，抑制病毒对宿主细胞的吸附或复制，并参与体内其他抗病毒保护机制，达到中和病毒的目的[5]，同时单克隆抗体作为一种被动免疫制剂，可促进机体的主动免疫反应，促进患犬康复[6]，所以具有中和活性的CPV单克隆抗体被用作治疗CPVD的常规药物之一[7]。
犬细小病毒（CPV）属于细小病毒属，是单负股DNA病毒。病毒粒子很小，是等轴对称的二十面体，在电子显微镜下观察呈圆形或六边形，无囊膜[8]，直径约25 nm[9]。CPV基因主要编码结构蛋白VP1、VP2、VP3和非结构蛋白NS1、NS2。VP1和VP2两种蛋白组成核衣壳[10]，VP2还是主要的结构成分和免疫原性蛋白，能够促使机体产生中和抗体[11]，对外界有较强的抵抗力。该病毒在1977年首次分离获得[12]。
CPV只有一个抗原型即CPV2型，但是它会在动物体内产生变异，现已发展为CPV2a、CPV2b、CPV2c(a)和CPV2c(b) 4个不同的亚型，目前我国主要流行CPV2a型[13]。经过几年的连续传播，CPV已经发生抗原漂移，在宿主范围、血凝性和抗原性上都有所改变，可以利用特异性单克隆抗体进行区别。
本试验将提纯的CPV免疫接种BALB/c小鼠，取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合，通过间接ELISA检测法检测筛选出效价高的阳性杂交瘤细胞株进行克隆，最终得到需要的杂交瘤细胞株，对小鼠进行腹腔注射获取大量CPV单克隆抗体，为建立特异、敏感、简便快速的CPV检测方法以及应用具有中和活性的CPV单克隆抗体进行临床治疗提供了良好的基础。
1.材料与方法
1.1主要材料
1.1.1 细胞、病毒、动物
SP2/0骨髓瘤细胞和F81细胞为本实验室保存；CPV为实验室保存、分离的JS12；BALB/c小鼠购自扬州大学动物试验中心。
1.1.2主要试剂
RPMI1640培养基、DMEM培养基和辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗鼠IgG抗体为本试验室制备；FITC标记的羊抗鼠IgG抗体和显色液购自武汉博士德生物工程有限公司；胎牛血清购自兰州民海公司；小牛血清购自上海慧人生物科技工程研究所；弗氏佐剂、聚乙二醇融合剂（PEG4000）、沉淀剂（PEG6000）、HAT和单克隆抗体亚类鉴定试剂盒购自Sigma公司。
1.1.3 主要仪器设备
超净工作台，高速台式低温高速离心机，落地式低温高速离心机，二氧化碳恒温箱，高速台式离心机，电子天平，酶标仪，倒置显微镜，倒置荧光显微镜等。
1.2制备方法
1.2.1 CPV的纯化
（1）将1000 mL细胞培养物反复冻融3次，4℃，8000 rpm，离心20 min，取上清液，加入PEG6000和NaCl，使溶液终浓度分别达到9%和3%，4℃磁力搅拌2 h，过夜沉淀；

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