猪链球菌是猪的重要致病菌，同时也是人畜共患病原菌。前期研究发现，猪链球菌蛋白酶ClpC是可能的毒力因子。为明确ClpC对猪链球菌毒力的影响，本研究构建ClpC缺失株ΔClpC，并研究其对猪链球菌致病性的影响。用穿梭质粒pSET-4s构建ΔClpC，通过PCR检测和测序，证实ΔClpC构建成功；野生株和缺失株分别以攻毒剂量为1.0×109活菌数/只和2.0×108 活菌数/只攻毒BALB/c小鼠，二者在小鼠死亡时间和数量上无显著差异；将同等剂量的野生株和缺失株混合后，竞争感染试验表明，野生株在24小时后在血液、脾脏、脑中的细菌数显著多于缺失株。因此，本研究结果证实ClpC与猪链球菌毒力相关，为深入研究其在猪链球菌致病中的作用奠定基础。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法2
材料 2
菌株、质粒和引物 2
主要试剂与酶2
培养基3
仪器3
实验动物3
1.2 方法 3
1.2.1 SS21基因组DNA的提取3
1.2.2 ClpC基因上下游同源臂序列和氯霉素抗性基因的扩增3
1.2.3 基因缺失质粒pSET4S::ClpC的构建4
1.2.3.1 融合PCR反应4
1.2.3.2 融合片段全长扩增4
1.2.3.3 重组质粒pSET4S::ClpC的构建4
1.2.4 基因缺失株的筛选与鉴定5
1.2.4.1 猪链球菌SS21感受态细胞制备5
1.2.4.2 电转化进SS21感受态细胞5
1.2.4.3 基因缺失株的筛选5
1.2.5 ClpC缺失株与亲本株的致病性实验6
1.2.6 ClpC缺失株与亲本株的竞争性实验6
2 结果与分析6
2.1 同源重组片段ClpC的获得6
2.2 重组敲除质粒pSET4s::ClpC 的鉴定7
2.3 敲除突变株ΔClpC 的PCR 鉴定7
2.4 小鼠感染 *51今日免费论文网|www.jxszl.com +Q: *351916072* 
实验8
2.5 竞争感染实验8
3 讨论10
致谢11
参考文献11
猪链球菌ClpC蛋白酶基因缺失株的构建
及其对细菌毒力的影响
引言
猪链球菌（Streptococcus suis, SS）是一种具有荚膜的革兰氏阳性菌，根据荚膜多糖抗原的差异，猪链球菌具有多种血清型，其中血清型为1、2、7、9型分离率较高。作为一种重要的人畜共患病原菌，该菌不仅给全球养猪业造成巨大的经济损失，还严重危害公众健康[1]，在这几种致病性血清型中，猪链球菌2型（SS2）是致病性最强，临床分离率最高的血清型。SS2感染猪后，猪会患脑膜炎、败血症、关节炎、肺炎等病症,甚至会出现急性死亡的状况；猪链球菌2型感染人后会导致脑膜炎和链球菌中毒性休克综合征等[2]。截止到2012年，人感染猪链球菌病例总数接近1600例，是2009年数据的两倍。尤其是1998年和2005年，中国江苏和四川分别暴发大规模猪链球菌疫情，不仅造成大量猪死亡，也导致多人感染和死亡[3]。
SS2在感染过程中，通过对相关毒力因子调控和表达，从而破坏机体的免疫防御。该菌的致病因子有荚膜、溶菌酶释放蛋白(MRP)、细胞外因子(EF)、溶血素等。荚膜可以保护细菌，抵抗吞噬，溶菌酶释放蛋白、细胞外因子的存在提高了菌株的致病力[4]。
有研究表明，细菌蛋白酶可作为猪链球菌2型的重要毒力因子，它们通常位于细菌表面或分泌到胞外，在细菌的感染过程中不但能帮助其侵袭宿主组织和获取营养，并可抑制或破坏宿主的免疫系统[5]。SS2中与毒力相关的蛋白酶有十余种，包括丝氨酸蛋白酶、二肽酶等[6]。Clp 蛋白酶最初是在大肠杆菌中发现，该蛋白酶在生物蛋白质代谢调控中发挥重要的作用；它不仅可调节代谢途径中限速酶，从而控制代谢过程，还可以清除细胞内一些具有潜在毒性的不可逆损伤蛋白质[7]。Clp蛋白酶由催化亚基和调节亚基构成，其中催化亚基为含有丝氨酸蛋白酶活性位点的ClpP蛋白，调节亚基为存在于细菌中高度保守的Clp ATP酶[8]。
作为Clp ATP酶的重要成员之一，对ClpC蛋白酶的研究大多数集中在枯草芽孢杆菌中。ClpC蛋白以ClpCMecAComK/S的形式由ClpP降解，从而调控枯草芽孢杆菌感受态的形成[9]。SS2基因组含有编码的ClpP和5种Clp ATP酶的基因，包括：ClpB、ClpC、ClpE、ClpL和ClpX。前期研究发现，ClpC在SS2丝氨酸/苏氨酸激酶缺失株中表达量显著下降，推测其可能参与调控猪链球菌的应激和毒力等[10]。本实验利用同源重组基因敲除的方法构建猪链球菌2型强毒株SS21 ClpC基因缺失株，采用组合PCR和基因测序等方法验证缺失株，利用BALB/C小鼠感染模型来评价缺失株的毒力，为后续研究SS2中的蛋白酶ClpC的功能奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株、质粒和引物 本实验所用的菌株、质粒及引物见表1, 引物由上海英骏
公司合成。
表1 实验所用的菌株、质粒和引物
Table 1 Bacterial strains, plasmids and primers used in this study
菌株、质粒及引物
Strains,plasmids and primers
表型及相关特征
Phenotypes and correlative characters
来源
Sources
菌株
Strains

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