钙黏素和整合素家族蛋白用于精原干细胞的流式细胞仪分离效率初探【字数：7646】
目录
摘要3
关键词3
Abstract3
Key words3
引言3
1材料与方法3
1.1材料 3
1.1.1 实验动物3
1.1.2 实验试剂4
1.1.3 实验仪器4
1.1.4 实验所需溶液的配制4
1.1.5实验所需PCR引物序列4
1.1.6实验所需抗体4
1.2实验方法 4
1.2.1 两步酶消化法提取精原干细胞4
1.2.2精原干细胞RNA的提取5
1.2.3 RTPCR反应提取cDNA5
1.2.4 PCR扩增5
1.2.5 cDNA凝胶电泳6
1.2.6 小鼠精原干细胞免疫荧光实验6
1.2.7 流式细胞仪分析ITGA6在精原干细胞分选中的效率7
2 结果与分析7
2.1 实验结果7
2.1.1 小鼠精原干细胞的分离及培养7
2.1.2 精原干细胞的鉴定7
2.1.3流式细胞仪进行分析8
2.2 分析8
2.2.1 精原干细胞鉴定结果分析8
2.2.2 流式细胞仪结果分析9
3 讨论 9
致谢10
参考文献10
钙黏素和整合素家族蛋白用于精原干细胞的流式细胞仪分离效率初探
引言
引言 精原干细胞是雄性动物的生殖干细胞，位于睾丸的曲精细管基膜处，有自我更新，增殖和定向分化为精母 *51今日免费论文网|www.51jrft.com +Q: ^351916072^
细胞的能力[1]，其独特的能力使之备受关注。哺乳动物体内的精原干细胞数量较少，其中成年小鼠的精原干细胞数仅占其生殖细胞数的0.02%—0.03%[2]，而细胞较少不利于细胞的体外培养，故若要研究精原干细胞需进行分离提纯。根据生物学特点，出生58d的小鼠睾丸内精原干细胞含量较高[3]，较易获得精原干细胞，故实验选用出生后58d小鼠为实验对象。流式细胞仪是通过精原干细胞表面标记分子的单克隆抗体分离出精原干细胞，可信度较高。对于小鼠精原干细胞的表面标记分子，各实验室已有较多的研究，且发展已较完善，并已应用于许多实验，如常用于实验室鉴定的ITGA6、ITGB1、GFRA1、THY1、CD9、CDH1、LIN28、GPR125、ZBTB16(PLZF)、POU5F1(OCT4)、ID4和NANOS2等。本实验选用钙黏素和整合素家族蛋白进行流式细胞分选，挑选出最适用于分离精原干细胞的细胞表面标记分子。
1 材料与方法
1．1 材料
1．1．1 实验动物 本实验需要的5d雄性ICR乳小鼠购自江苏南京青龙山动物繁育场，小鼠的处死操作严格按照大学实验动物操作规范进行。
1．1．2 实验试剂 异丙醇（Sigma公司），无水乙醇（南京化学试剂有限公司），甲醇（南京化学试剂有限公司），冰醋酸（上海凌峰化学试剂有限公司），胎牛血清（FBS）（Gibco公司），胰酶（Amresco）,氯仿
1. 1. 3 实验仪器 电子天平（Ohaus），倒置显微镜（Olympus），手动微量移液器（Eppendorf），超净工作台（苏净安泰公司），冷冻离心机（Thermo Fisher Scientific），细胞培养箱（Thermo Fisher Scientific），超低温冰箱（Thermo Fisher Scientific），恒温水浴锅（中贝仪器），PVR仪，荧光显微镜，流式细胞仪
1. 1. 4 实验所需溶液的配制
DHanks溶液（1L）：使用天平精确称量KH2PO4 0.06g， Na2HPO412H2O 0.132g，NaCl 8.0g，NaHCO3 0.35g，KCl 0.4g，将其全部溶解于800ml的去离子水中，调溶液的pH至7.3，用1L容量瓶定容，再于超净台上使用滤网过滤，做好标记后置于4℃冰箱保存；
MEF培养液（100ml）：使用量筒准确量取DMEM 88ml，L谷氨酸1ml，青霉素0.5ml，FBS 10ml ，并将其置于100ml玻璃瓶中混匀，再使用0.22μm过滤筛过滤溶液，将过滤后的溶液置于新的玻璃瓶中，做好标记后置于4℃冰箱保存；
10×PBS溶液（1L）：使用天平准确称量Na2HPO412H2O 36.3g，KH2PO4 2.4g，KCl 2g，NaCl 80g，将其全部置于已用量筒量取800ml去离子水的烧杯中，用磁力搅拌棒进行溶解，溶解完成后转移至1L容量瓶中，加去离子水定容，使用前需将溶液稀释10倍，并调节pH至7.3；
1mg/ml胶原酶Ⅳ（50ml）：使用高精度天平准确称取50mg的胶原酶Ⅳ的粉剂，将其溶解于用量筒量取的50ml DHanks中，搅拌，使其充分溶解，再使用0.22μm过滤筛过滤溶液，将过滤后的溶液置于新的玻璃瓶中，做好标记后将其置于4℃冰箱保存；
0.05%胰酶（50ml）：使用高精度天平准确称取25mg胰酶粉剂，将其溶解于用量筒量取的50ml DHanks溶液中，搅拌，使其充分溶解，使用移液枪缓慢地逐滴加入50μl EDTA溶液，再在超净台中使用滤网过滤除菌，将其密封后做好标记，置于4℃冰箱保存。
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