目的 探讨阿特拉津对绵羊睾丸间质细胞增殖与凋亡的影响。方法 选取新鲜的绵羊睾丸，分离并纯化LCs，建立原代培养模型。分别设置10、25、50、100、125、150、175、200 μmol/L染毒组与溶剂对照组，对LCs进行12 h染毒后，采用cck8试剂盒检测LCs活力，根据结果选取合适的染毒组进行后续试验。Edu掺入法检测染毒组和对照组的细胞增殖情况，使用Elisa法检测培养液中的睾酮浓度，定量PCR检测凋亡相关基因BAX、Bcl-2、p53、caspase-3和caspase-9，自噬相关基因LC3以及Beclin-1，睾酮合成相关基因STAR、HSD3β、CYP11A1和CYP17，氧化应激相关基因CAT、SOD2 和GSH-px的mRNA表达量变化，Western blot检测Beclin-1与p53蛋白含量变化。结果 随着染毒浓度增加，细胞活力呈下降趋势，在200 μmol/L浓度时仅有对照组的20%。细胞增殖数量也随染毒浓度增加逐步下降。随着染毒浓度增加，睾酮分泌量呈下降趋势，在100 μmol/L处最为显著（P＜0.05）。随着染毒浓度增加，BAX、p53、caspase-3、caspase-9、LC3、Beclin-1、CAT、SOD2和GSH-px表达量呈上升趋势，STAR、HSD3β、CYP11A1、CYP17和Bcl-2表达量呈下降趋势；Beclin-1与p53的蛋白含量呈上升趋势。结论 ATZ染毒会降低细胞活力与增殖能力，使LCs中氧化应激、自噬、细胞凋亡相关基因表达上调，睾酮合成相关基因表达下调。最终导致LCs数量减少，睾酮分泌量降低。
目录
摘要3
关键词3
Abstract3
Key words3
引言4
1材料与方法4
1.1 材料 4
1.2 间质细胞体外培养6
1.3 ATZ染毒处理6
1.4 cck8检测细胞活力6
1.5 Edu染色检测染毒组细胞增殖情况6
1.6 Elisa法检测培养液中睾酮浓度6
1.7 实时荧光定量PCR6
1.8 Western blot检测蛋白表达水平7
1.9 统计学分析8 *51今日免费论文网|www.jxszl.com +Q: ^351916072# 

2 结果8
2.1 ATZ对间质细胞活力影响8
2.2 ATZ对间质细胞增殖能力影响8
2.3 ATZ对睾酮浓度影响9
2.4 ATZ对氧化应激相关基因影响9
2.5 ATZ对细胞自噬相关基因影响10
2.6 ATZ对细胞凋亡相关基因影响10
3 讨论 11
致谢12
参考文献12
除草剂阿特拉津对绵羊睾丸间质细胞增殖与凋亡的影响
动物科技学院学生 王梓乔
引言
阿特拉津（Atrazine），化学名为2氯4二乙胺基6异丙胺基1，3，5三嗪，是一种低毒的除草剂。阿特拉津首次使用于1959年，因其价格低廉，在农业生产中得到广泛的应用，但同样也是近年来国际社会广泛关注的重要环境污染物之一。阿特拉津毒性较低，但因其化学结构稳定，难以降解，可经常在大气、水与土壤中发现残留，在人与动物体内也会被检测到[1]，若在环境中长久存在将会危害到人类的健康。早在2010年就有研究人员发现，阿特拉津会干扰雄蛙的激素分泌，使雄蛙变性[2]。在此后的多项研究结果显示，阿特拉津是一种内分泌干扰物，具有与天然性激素相近的对血清组分的结合能力[3]，并可能与天然性激素发生竞争，引发生殖功能障碍，导致睾丸发育异常，干扰精子生成[4]。
睾丸间质细胞，即Leydig细胞（LCs）。分布于生精小管之间的疏松结缔组织中，细胞含量占睾丸总细胞数的2%4%。其主要功能是合成和分泌雄激素，其中睾酮占比超过95% [5]。睾酮是一类活性最强的雄激素，它在促进雄性生殖机能的发育、精子的发育成熟以及维持雄性生殖器官的正常生理功能上均起到重要作用，同时还能促进部分机体蛋白质的合成。
氧化应激、细胞的自噬与凋亡都是细胞中十分正常的生物学现象。当机体在遭受各种有害刺激时，体内高活性分子产生过多，氧化系统和抗氧化系统失衡，就会发生氧化应激，导致机体损伤。自噬则具有多种生理功能，包括耐受饥饿，清除细胞内折叠异常的蛋白质或蛋白质聚合物、受损或多余的细胞器，促进发育和分化，延长寿命，清除微生物等。细胞凋亡是指为维持内环境稳定，由基因控制的细胞自主的有序的死亡。细胞凋亡是主动的，为更好地适应生存环境而主动争取的一种死亡过程。当细胞处于异常环境时，氧化应激、细胞的自噬与凋亡的发生都会更加频繁。
近年来，阿特拉津的内分泌干扰效应和生殖毒性已引起研究者越来越多的关注。在大鼠身上的试验显示阿特拉津可导致雄性啮齿类动物产生生殖器官变性萎缩、生精过程受阻、睾丸标志酶活性下降、性激素水平紊乱等毒性作用[6]。当前阿特拉津毒性试验大多是在小鼠与大鼠身上进行，大型动物身上的相关试验较少。细胞体外毒性试验简便、省时、易重复、毒性终点明确，是一个生殖毒理学研究中的优秀方法。本试验拟研究阿特拉津对原代培养的绵羊间质细胞的增殖、凋亡及睾酮分泌的影响，为探讨阿特拉津对间质细胞的毒性作用机制提供理论基础。
1 材料与方法
1．1 试剂与仪器
1．1．1 试剂
阿特拉津（C8H14CIN5，纯度97％，J＆K百灵威科技）
绵羊睾酮激素Elisa试剂盒（上海卡迈舒，DRES5771c）
Trizol（Invitrogen, 15596026）
反转录试剂盒（TaKaRa, DRR047）
荧光定量试剂盒（Vazyme, Q11102）
LA Taq酶（TaKaRa, DRR002A）
DL2000 DNA Marker（TaKaRa, 3427A）。
RIPA 裂解和提取缓冲液（Thermo Pierce，89900）
PMSF（碧云天，ST505）
磷酸酶抑制剂混合物（凯基生物，KGP602）
还原剂 (10×)（Thermo Pierce，NP0009）
LDS上样缓冲液(4×)（Thermo Pierce，NP0007）
彩虹预染蛋白质Marker（Thermo Pierce，26616）
MES SDS电泳缓冲液（20×）（Thermo Pierce，NP0002）
转印膜缓冲液（20×）（Thermo Pierce，NP00061）
超敏ECL显影液（Thermo，34580）
柠檬酸钠抗原修复液（50×）（Solarbio，C1032）

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