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摘要 I
引言
我国养羊业历史悠久，山羊品种资源丰富。近年来，我国羊肉消费呈现增长趋势，同时肉羊养殖正由传统农户养殖快速向规模化、产业化养殖转型，导致养殖业对种公羊的数量及质量要求也日益提高。因此，研究雄性山羊生殖发育及性成熟的调控机制以帮助提升其繁殖性能对肉羊业的发展有重大意义。
线粒体是机体的“能量工厂”，是糖类、脂肪及氨基酸等物质被氧化磷酸化最终为细胞的生命活动如睾丸的发育、精子的发生、激素的分泌等提供能量的场所；是睾酮（T, testosterone）合成的限速步骤发生的部位[1]；还参与生殖细胞凋亡的调控[2]。精子的线粒体可通过氧化磷酸化联合细胞内的糖酵解反应为精子运动提供能量，而且还是活性氧（ROS, reactive oxygen species）产生的主要场所。研究证实，少量ROS能促进精子获能，维持其功能；过量的ROS能损伤精子DNA，导致精子能量代谢异常，活力下降，甚至加速其凋亡。精子活力与线粒体呼吸、氧化磷酸化功能有紧密联系，且呈正相关[3]。以上都说明，线粒体从多个方面参与调控动物生殖系统的发育，在维持动物生殖功能方面扮演着重要的角色。
过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅助激活因子1α（PPARGC1A或PGC1α, peroxisome proliferatoractivated receptor γ coactivator1α）是近年来新发现的一种高表达于含线粒体丰富或氧化代谢活动活跃的组织中的核辅助激活因子，在线粒体的生物合成和功能上起着十分重要的调控作用。PPARGC1A启动子序列中含有胰岛素应答序列（IRSs, insulin response sequence）、cAMP应答元件（CRE, cAMP response element）等顺式作用元件。此外，PPARGC1A上游核苷酸序列处存在两个肌细胞增强因子2（MEF2, myocyte enhancer factor 2）结合一致序列[CTA(A/T)4TAG/A]。在不同条件下，这些顺式作用元件结合转录因子后通过不同通路调控PPARGC1A的表达。近年研究较为深入的调节PPARGC1A表达的通路是MEF2/HDACs调节通路、PI3K/PKB/FKHR调节通路和CREB/CRE调节通路。PP *51今日免费论文网|www.jxszl.com +Q: ^351916072^ 
ARGC1A参与线粒体PPARGC1ATFAM通路的构成，其下游因子为核呼吸因子（NRFs, nuclear respiratory factors），以及线粒体转录因子A（TFAM, mitochondrial transcription factor A）。NRFs是一类转录因子，其由核基因编码，可参与调控线粒体呼吸链的表达。主要是NRF1（Nuclear Respiratory Factor 1）和NRF2（Nuclear Respiratory Factor 2）两种。线粒体DNA（mtDNA, mitochondrial DNA）的表达主要受核基因组的调控，而NRF1就是负责调控mtDNA转录及复制的核调节因子。NRF1不但通过间接方式影响mtDNA的转录及复制来调控线粒体的呼吸链，还参加很多与细胞呼吸非直接相关的基因调控[4]。TFAM除了参加线粒体转录的激活和线粒体基因组的复制，还可以调节mtDNA的拷贝数，改善线粒体功能，是在线粒体的生成方面起重要作用的因子[5]。TFAM基因启动子上包含许多转录因子的结合位点，其中包括NRF1的结合位点。研究表明，NRF1的结合是启动子功能的主要决定因素，若NRF1在TFAM启动子上的结合位点发生突变，TFAM活性会显著降低。另外，还有研究发现NRF1的磷酸化可以刺激TFAM的转录。研究表明PPARGC1A主要通过以下3方面调控线粒体的生成：①与NRF1共同调节线粒体呼吸；②与NRF1和NRF2结合共转录，激活TFAM、TFB1M（Transcription Factor B1, Mitochondrial）和TFB2M（Transcription Factor B2, Mitochondrial）等的表达，调节线粒体的转录；③通过诱导线粒体脂肪酸和亚铁血红素的生物合成途径提高线粒体的氧化功能。
尽管有研究报道线粒体可以为睾丸的发育提供能量并与多种通路互相作用参与睾丸内生殖细胞功能的调节，但目前关于PPARGC1A基因如何参与调控睾丸发育，如何影响动物性成熟的研究还很少。因此，本试验以雄性山羊作为研究对象，选取3月龄及9月龄的健康个体分别代表性成熟前及性成熟后，通过ELISA法测定性成熟前后山羊血液中睾酮、瘦素、胰岛素以及胰岛素样生长因子I的浓度；IHC法测定性成熟前后山羊睾丸组织中PPARGC1A蛋白的表达定位；qRTPCR测定性成熟前后山羊睾丸组织中PPARGC1A基因的差异表达，探索PPARGC1A基因在雄性山羊性成熟前后睾丸组织中的表达变化。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1试验动物
选取来自江苏省海门市江苏金盛山羊繁育技术发展有限公司的3月龄（3monthold）和9月龄（9monthold）的雄性山羊各4只，要求试验动物体重相近，体况较好，谱系清晰。
1.1.2样品的采集与保存
颈静脉采血获得其血液样本，保存于20℃，用于之后检测血液中的T、胰岛素、瘦素和IGF1浓度。
手术摘取试验羊睾丸，经生理盐水冲洗后，将其分为两部分，一部分浸泡于Bouin’s固定液中保存，用于免疫组化检测试验；另一部分保存于液氮中，用于提取RNA，进行qRTPCR。
1.1.3主要溶液配制
Bouin’s固定液：量取饱和苦味酸溶液75 ml，甲醛溶液25 ml，冰醋酸溶液5 ml，混合后置于4 ℃下备用，现配现用。
DAB显色液：称取DAB粉剂600 mg溶于6 mL的1×PBS中，摇匀后将其分成每份300 μL分装，待显色时将300 μL的DAB溶液加入到200 mL的去离子水中，然后再加入30 μL的30 % H2O2。

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