【试验目的】本试验通过用不同浓度leptin来处理公鸡睾丸内间质细胞，以探索leptin对间质细胞睾酮分泌的影响。【试验方法】本实验以公鸡睾丸为研究对象，体外培养公鸡睾丸内间质细胞，分别用0 ng、1 ng、5 ng、10 ng、100 ng、300 ng、500 ng/mL的leptin处理公鸡间质细胞（0 ng为对照组），收集培养液后用睾酮试剂盒来检测细胞培养液中睾酮 T的浓度。【试验结果】用leptin处理间质细胞可以使其睾酮分泌受抑制（P<0.05），其中在leptin含量为50 ng、100 ng时显著抑制，睾酮分泌量最低（P<0.01），而更高浓度的leptin对睾酮分泌抑制作用并未更强（P>0.05）。【试验结论】在leptin浓度为50 ng/mL时就可以对公鸡睾丸内间质细胞分泌睾酮产生显著的抑制作用。
目录
摘要 3
关键词 3
Abstract 3
Key words 3
1 材料与方法 5
1.1 材料 5
1.1.1 实验时间、地点 5
1.1.2 实验动物 5
1.1.3 主要试剂 5
1.1.4 主要仪器设备 5
1.2 实验方法 5
1.2.1 主要溶剂配置 5
1.2.2 公鸡睾丸间质细胞体外分离培养 6
1.2.2.1 细胞悬液制取 6
1.2.2.2 Percoll不连续密度梯度离心 6
1.2.2.3 细胞接种、leptin处理 6
1.2.2.4 添加leptin刺激间质细胞 7
1.2.3 间质细胞活率鉴定 7
1.2.4 睾酮浓度测定 7
1.3 数据统计 7
2 实验结果 8
2.1 间质细胞活率 8
2.2 睾酮分泌浓度 8
2.2.1 低浓度leptin对睾酮分泌的影响 8
2.2.2 高浓度leptin对睾酮分泌的影响 9
3 讨论 10
3.3 两批次睾酮含量不同的原因 10
3.2 leptin对 *景先生毕设|www.jxszl.com +Q: ￥351916072$ 
睾酮分泌的影响 10
致谢 11
参考文献 11
Leptin 对公鸡间质细胞生长和分泌睾酮的影响
引言
瘦素（Leptin），是小肽类激素，主要由白色脂肪组织分泌，Leptin通过与之受体结合，可发挥对动物繁殖性能、采食、体重生长、能量平衡和免疫活性等生物学过程的调控作用。Leptin在1994年首次在小鼠中成功克隆[1,2]，此后有关Leptin对于动物的生理功能的影响的研究增多。然而，这些研究大多数都是针对哺乳动物，尤其是人和鼠。虽然鸡Leptin及其受体基因的DNA序列再之后也相继被报道，但是针对于Leptin是否存在于家禽中这一观点一直没有得到准确肯定。因此由于缺乏禽类内源性Leptin，对鸡Leptin受体功能的研究也受到限制。
根据研究发现[3]，Leptin的基因组序列包含2个内含子（Intron）、3个外显子（Exon），其内显子中，Intron1的长度为10686个碱基、Intron2长度为2243个碱基；外显子中，Exon1是不编码氨基酸，由30个碱基组成；Exon2是由182个碱基组成的，包含一段63bp的信号肽序列；Exon3由3216个碱基组成；在编码区（CDS）中GC含量达55%，全长为504个碱基。Leptin蛋白结构模型我们可得知表明，Leptin由四个疏水核（Helix AD）构成，属于高度亲水性多肽，其间有Loop区连接（图1）。


图 1 鼠Leptin蛋白的三级结构
Fig. 1 Tertiary structure of Leptin in mouse
相较于其他动物，家禽Leptin拥有独特的组织表达模式，其能够控制家禽脑补的能量平衡、对繁殖进行调控，在肌肉发育中也起到重大的作用。然而，根据此前的研究所报道的家禽Leptin基因核苷酸序列实验仅仅只是偶尔获得有效的成果，并不能重复实现，因此人们对其存在的真实性产生了质疑[4,5]。虽然此后不断地有报道有关于禽类Leptin的基因克隆[6]，也有实验证明所谓的的禽类Leptin基因在家禽中存在的真实性[7]，但人们的质疑依旧存在。随着时间推移和技术的不断发展，使得人们在更深层次（如基因组、蛋白组、转录组）和更大范围（种属）上探究禽类Leptin基因存在的真实性。直到2014年，野生鸟类Leptin基因的成功克隆[8,9,10]，打消了人们对禽类Leptin基因存在的质疑，突破了禽类Leptin研究的瓶颈。直到现在禽类Leptin（尤其在家禽中）的功能、表达和克隆一直都是研究的热点，但是大部分实验都是依靠注射Leptin后观察禽类反应等来研究，但没有涉及到用leptin处理间质细胞。
在还没有成功克隆出真正的禽类Leptin基因时，就已经有研究人员对所谓的“鸡Leptin基因”进行了实验，他们体外表达了“鸡Leptin基因”并制备出相应的抗体，利用这些体外表达的“鸡Leptin”或鼠源Leptin、人源Leptin等对禽类的生物学功能进行研究。虽然上述的研究只能表明禽类Leptin具有一定的生物学功能，但是并不能反映禽类真正内源性Leptin所具有的生理功能[11]。但从某种程度上，这些实验也具有一定的借鉴意义，对开展真正禽类内源性Leptin的生理功能的研究也起到了重大作用。
研究发现，通过leptin处理过的动物卵巢和睾丸显著增重，且其中的FSH、LH水平与对照组相比有较大幅度的提高[12]。前期研究发现，公鹅睾丸早期发育收到免疫LEPR的影响，而影响睾丸发育主要是影响间质细胞和支持细胞。由于血睾屏障的原因，免疫LEPR产生的抗体并不能直接作用与支持细胞。而间质细胞中含有一系列能够将淋巴和睾丸组织中高浓度胆固醇转化为雄激素的类固醇激素合成酶，这些雄激素对于雄性特征的维持和促进雄性性腺发育非常重要。
本试验旨在通过用leptin处理公鸡睾丸间质细胞，以探索leptin对间质细胞类固醇激素分泌的影响，能一定程度加速leptin对家禽生殖影响机制研究的进展。
1 材料与方法
1.1 材料

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