目的为探究玉竹多糖的免疫调节活性，为开发源自天然药物、具有自主知识产权的家禽免疫增强剂提供理论基础。方法采用煎煮法提取玉竹多糖，分级醇沉、三氯乙酸脱蛋白法纯化多糖，MTT法测定玉竹多糖对外周血T淋巴细胞、脾脏B淋巴细胞和树突前体细胞增殖作用的影响。结果水提醇沉法共得POPS30（30%醇沉玉竹多糖）、POPS50（50%醇沉玉竹多糖）、POPS80（80%醇沉玉竹多糖）3种产物，提取率分别为2.06%、3.56%、17.64%。POPS30、POPS50、POPS80蛋白脱除率分别为32.50%、17.31%、13.69%，多糖损失率为17.64%、13.48%、1.93%。细胞试验表明相对于细胞对照组，POPS30、POPS50、POPS80在78.13~19.53μg/ml时，对外周血T淋巴细胞刺激增殖效果极显著高于其它浓度，且在19.53μg/mL时，刺激效果最为明显；其对脾脏B淋巴细胞均呈先促进后抑制细胞增殖趋势，多糖浓度在1250.00μg/mL时，促进B淋巴细胞增殖作用最为明显，不同醇沉浓度多糖间略有差异；多糖浓度156.25~39.06μg/mL时，其对树突前体细胞刺激增殖作用明显，且于39.06μg/mL时，刺激效果最为显著。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法2
材料 2
试验材料2
1.1.2主要试剂2
1.1.3 主要仪器2
1.2 方法 2
1.2.1提取及分级醇沉2
1.2.2脱蛋白及蛋白脱除率的计算2
1.2.3透析2
1.2.4玉竹多糖的蛋白含量测3
1.2.5玉竹多糖的含量测定3
1.3 多糖对鸡T淋巴细胞、B淋巴细胞和前体树突状细胞增殖作用的影响 3
2 结果与分析4
2.1 玉竹多糖提取率及脱蛋白对多糖含量的影响4
2.1.1 葡萄糖标准曲线的绘制 4
2.2.2 玉竹多糖提取率及脱蛋白对糖含量的影响4
2.2 三氯乙酸法蛋白脱除率结果分析4
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2.2.1 牛血清白蛋白标准曲线绘制4
2.2.2 三氯乙酸脱蛋白法对不同醇沉浓度多糖蛋白脱除率影响5
2.3不同醇沉浓度玉竹多糖单独刺激外周血T淋巴细胞增殖的变化5
2.4 不同醇沉浓度玉竹多糖单独刺激脾脏B淋巴细胞增殖的变化5
2.5 不同醇沉浓度玉竹多糖单独刺激树突前体细胞增殖的变化6
3 讨论 7
3.1 水提醇沉法及玉竹多糖的提取率7
3.2 三氯乙酸法纯化玉竹多糖的蛋白脱除率及多糖损失率8
3.3 MTT法测定不同醇沉浓度多糖免疫调节活性8
3.4 玉竹多糖研究展望8
致谢 8
参考文献9
玉竹多糖提取、分离纯化及对鸡免疫细胞增殖能力的影响
引言
中药玉竹为百合科植物玉竹Polygonatum odoratum (Mill.) Druce的干燥根茎，作为常见的药食两用的植物，应用历史源远流长，具养阴润燥，生津止渴之功效[1]。现代药理学研究表明，玉竹具有免疫调节、降血糖、抗衰老等诸多功效[2]。玉竹多糖是玉竹具有诸多药理活性的主要成分之一，其单糖组成主要为葡萄糖、甘露糖、葡萄糖醛酸、阿拉伯糖、鼠李糖和半乳糖等，具有抗氧化、抗肿瘤、调节血糖、抗疲劳和免疫调节等药理活性[3]。文献中有关玉竹多糖免疫调节活性的报道相对较少，有进一步研究和开发的前景。
B淋巴细胞和T淋巴细胞是动物获得性免疫的主要免疫细胞，直接参与动物特异性免疫的整个过程，保持机体的免疫平衡。树突状细胞是专职的抗原提呈细胞，在免疫系统中具有中心枢纽作用。以上述三种细胞为靶细胞，通过测定中药活性成分对其增殖情况的影响，有助于更加科学、全面地研究中药的免疫调节作用[58]。
为了探究玉竹多糖的免疫调节活性，明确玉竹多糖对淋巴细胞和树突状前体细胞的功能调节作用，本试验采用水提醇沉法提取玉竹粗多糖，三氯乙酸法、分级醇沉法纯化粗多糖，以B淋巴细胞、T淋巴细胞和树突状前体细胞为细胞筛选模型，研究不同醇沉浓度多糖对上述3种细胞的增殖作用影响，为进一步研究玉竹多糖的免疫调节作用提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 试验材料 玉竹Polygonatum odoratum (Mill.) Druce（批号20170901）购自于南京天元大药房。
1.1.2 主要试剂 苯酚，分析纯，水华化学科技(江苏)有限公司；D (+)葡萄糖，分析纯，中国惠兴生化试剂公司；考马斯亮蓝 G250，四甲基偶氮唑蓝( MTT)，青链霉素，北京索莱宝科技有限公司生产；二甲亚枫(DMSO)，三氯乙酸，国药集团化学试剂有限公司；小牛血清，杭州四季青生物制品厂；人外周血淋巴细胞分离液，天津市灏洋生物制品科技有限公司；LMRPMI 1640、DMEM，通用电气医疗集团；无水乙醇、浓硫酸，分析纯，南京化学试剂有限公司；磷酸盐缓冲液(PBS) (PH 7.17.3)，自配。
1.1.3 主要仪器 CO2培养箱，美国Revco公司；紫外可见光分光度计，上海菁华科技有限公司；旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂；FA1104N754型电子天平，上海精密科学仪器有限公司；TDL8802B离心机，上海安亭科学仪器厂；MultiskanTM FC型酶联免疫检测仪，Thermo公司；96孔和24孔细胞培养板，德国Nunclon公司。
1.2 方法
1.2.1 提取及分级醇沉 200g玉竹，90%乙醇回流提取2次，每次1h，滤过，药材低温烘干，再分别加入15倍水和10倍水，煎煮2次，第一次1.5h，第二次1h，滤过，合并滤液，浓缩至200mL，待冷却后依次加入无水乙醇至含醇量达30%、50%、80%，分别静置24h，抽滤，得30%玉竹粗多糖(POPS30)、50%玉竹粗多糖(POPS50)和80%玉竹粗多糖(POPS80)。干燥，称重，计算提取率，保存。
1.2.2 脱蛋白及蛋白脱除率的计算
采用三氯乙酸法 取各醇沉浓度下玉竹多糖1mg/mL溶液各50mL，缓慢加入体积分数为5%的三氯乙酸溶液，混匀剧烈震荡，在低温下(4℃)放置12h，冷却后离心(l0000r/min、l0min)。去除沉淀后，测上清液中蛋白质含量和多糖含量，反复进行至无蛋白层。将脱蛋白后的50ml溶液于透析袋中，夹好透析袋夹。静置于500mL自来水中透析，上接以流动水不断更换透析液，透析时间为72h，温度为25℃ ，透析后取上液，旋转蒸发后，低温真空干燥，精密称量，得精制POPS30、POPS50、POPS80。计算各醇沉浓度下蛋白脱除率。蛋白质脱除率的计算：
蛋白质脱除率/% =(M1M1)/M1×100
式中：Ml为未脱蛋白溶液蛋白含量，M2为脱蛋白后溶液蛋白含量
1.2.3透析
将脱蛋白后的50ml溶液装于透析袋中，夹好透析袋夹。静置于500mL自来水中透析，上接以流动水不断更换透析液，透析时间为72h，温度为25℃ ，透析后取出液体，旋转蒸发仪蒸发部分液体，低温真空干燥后，精密称量。

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