目 录
1 引言 1
1.1 细菌素 1
1.2 乳酸菌 1
1.3 传统筛选法与分子筛选法 3
1.4 发酵条件的优化 4
1.5 细菌素发展前景 4
2 实验部分 5
2.1 实验仪器与药品 5
2.2 所用培养基 6
2.3 主要实验仪器 7
2.4 实验方法 7
3 结果与讨论 11
3.1 规定抑菌等级 11
3.2 筛选及鉴定 11
3.3 抑菌因素排除 13
3.4 确定抑菌谱 15
3.5 发酵条件的优化 15
结论 27
致谢 28
参考文献 29
1 引言
1.1 细菌素
1.1.1 细菌素的定义和生物学意义
细菌素是细菌产生的一种抗菌物质，它是代谢过程中通过核糖体合成机制产生的一类具有抗菌活性的肽或前体肽（进一步被修饰为成熟的肽），抗菌对象主要是与产生菌分类上相似的细菌，但产生菌对自身分泌的细菌素有免疫性[1]。
细菌素是产生菌生存竞争的武器、是微生态平衡的调节剂。微生物通过分泌抗生素、细菌素等物质，在与众多微生物的生存竞争中，抑制或杀死竞争者。就现在所知，不论革兰氏阳性菌还是革兰氏阴性菌，都产生各种各样的细菌素或类细菌素，如凝结芽孢杆菌产生的coaguLin、大肠杆菌产生的coLicin、嗜盐杆菌产生的haLocin。各类细菌所处的生态位置和数量的稳定平衡，有时也要靠细菌素来维持。还有数据表明，细菌的多样化和进化也有细菌素的功劳。
1.1.2 细菌 *景先生毕设|www.jxszl.com +Q: ^351916072* 
素的研究现状
国外对乳酸菌细菌素的研究比较早，报道的文献资料很多[2]。我国是一个乳酸菌等细菌资源丰富的国家，但对乳酸菌细菌素的研究起步较晚，除了nisin的研究外[3],很少见到有关其它乳酸菌细菌素的报道。到目前为止已描述了40余种乳酸菌细菌素，它们是一群复杂的拮抗物,其分子量、生化特性、敏感范围及作用方式具有较大差异[4]。尽管人们早已认识到它们在食品发酵、食品保藏和肠道生态中具有重要的作用，但一直未能引起高度的重视。除了nisin研究最广泛，并唯一被允许作为防腐剂在食品中使用外[5]，其它则多限于一般特性的描述，对其遗传特性等的研究还不很深入。近年来随着分子生物学和生物技术的发展，有关细菌素尤其是乳酸菌细菌素的研究引起了广泛的关注。目前开发乳酸菌细菌素作为新型的天然食品防腐剂和饲料添加剂已成为研究的热点。
1.2 乳酸菌
1.2.1 乳酸菌的定义及基本特征
乳酸菌(Lactic acid bacteria，简称LAB)不是微生物分类学上的名词，而是指一群可利用碳水化合物发酵产生大量乳酸的细菌的统称[6]。它们具有一些基本特征：(1) 细胞形态为杆菌、短杆、球状和类球状；(2) 细胞染色呈革兰氏阳性、阴性，也有具阳性细胞壁型的阴性菌；(3) 细胞内有芽孢或无芽孢；（4）生理需求有好氧、厌氧或兼性厌氧；（5）代谢产物有以乳酸为唯一或主要产物，也有乳酸、琥珀酸、乙酸等的混合产物。
1.2.2 乳酸菌素抑菌作用机理
1.2.2.1 羊毛硫类乳酸菌素
这类乳酸菌素对革兰氏阳性菌的营养细胞和抱子均有作用。对营养细胞的作用主要是通过引起菌体细胞膜的变化；对芽抱的作用则是抑制萌发，而不是杀死芽饱。其活性部分含有羊毛硫氨酸(A-L-A)、甲基羊毛硫氨酸(A-B-A)、脱氢丙氨酸(DHa)和脱氢丁氨酸(DHb)等稀有氨基酸，其活性形式的形成必须经过翻译后酶的修饰。目前的研究结果认为，这类乳酸菌素对细胞的作用是在一定的膜电位存在下，吸附于敏感菌的细胞膜上，在其上形成通透性孔道，导致无机离子从细胞中流出，ATP泄漏，造成细胞膜内外能差消失，细胞外水分子流入，细胞自溶而死亡[7]。在此类乳酸菌素中研究最深、应用最广的就是Nisin，国内外均有许多关于Nisin结构与抗菌机理的综述。Nisin是由乳酸乳球菌分泌的一种线型多肤，其靶目标是细胞膜，通过侵入膜内形成通透孔道释放出胞内的离子(如K+)，从而引起质子驱动势(PMP)的丧失，造成电子传递体的解偶联，影响能量代谢并阻断蛋白质、DNA、RNA等大分子物质的合成等，最终引起细胞的死亡。因其作用需膜电位△V的存在，通过在膜上形成通道，降低膜电位和pH梯度，导致细胞内溶物外泄而抑菌，故又称为能量依赖型乳酸菌素。对于这类乳酸菌素疏水基团作用于膜的方式，存在不同的看法，大致可分为“栅栏”和“锲形”两种模式。“栅栏”模式是指每一个乳酸菌素分子都垂直插入膜中，形成栅栏形的横跨膜的离子通道；而“锲形”模式则是一定数量的乳酸菌素分子同时插入膜中形成一个锲形的通道[8，9]。
1.2.2.2 非羊毛硫类乳酸菌素
非羊毛硫类乳酸菌素的作用方式是破坏细胞膜的稳定性，也是在细胞膜上形成一个亲水孔道，但这个亲水孔道是经膜上特定的受体蛋白介导的，与膜电位无关，孔道使得细胞膜的通透性增强而引起细胞内各种 *景先生毕设|www.jxszl.com +Q: ^351916072* 
离子的渗漏，导致细胞解体死亡。发挥作用时不具有能量依赖性，即可导致细胞膜渗透屏障的丧失及质子动力的消失，因此非羊毛硫类乳酸菌素又称为非能量依赖型乳酸菌素。与羊毛硫类乳酸菌素相比，此类乳酸菌素的作用主要是破坏膜功能的稳定性(如能量传导)，而不是破坏膜结构的完整性[10]。
1.2.3 乳酸菌细菌素的分类
按结构、相对分子量、热稳定性、抗菌谱等特性，可将细菌素分为三大类[11]：第一类为羊毛硫细菌素（Lantibiotics），分子质量小，均在5 kDa以下，它是分子内硫醚环中含稀有氨基酸（羊毛硫氨基酸和β-甲基羊毛硫氨酸）修饰后的多肽。根据分子形状和作用方式又可分为A、B两型。A型为长形、阳离子成孔的多肽，如nisin、subtiLin、Lacticin481；B型分子为球形，是酶的抑制剂[12]和免疫蛋白，如mersacidin cinnamycin，它们能与靶细胞脂质Ⅱ形成复合体。两组分的羊毛硫细菌素如Lacticin3147 A1和A2由两个羊毛硫细菌素组成，有协同的抗菌作用。第二类为不含羊毛硫氨基酸、非修饰、分子质量小于10 kDa、热稳定、富含小氨基酸，通常为阳离子亲水亲脂的两性物质。又分为4个型：Ⅱa类（类片球菌素的细菌素）、Ⅱb类（二肽细菌素）、Ⅱc类（分泌依赖型细菌素）和Ⅱd类（其他细菌素）。很多乳酸菌如Pediococcus、Leuconostoc、Enterococcus和LactobaciLLus都产Ⅱa类细菌素[13]。第三类为大分子（>30kDa）、热不稳定的细菌素，在60-100℃，10-15min就失去活性，这类细菌素主要产自乳杆菌和肠球菌，如caseicin80、enteroLysin。到目前为止，对第一、第二类细菌素研究的较多。
传统的细菌素筛选法是利用指示菌株直接检测发酵液产物。近年来，基于对细菌素分子生物学研究的深入，诞生了一种新的细菌素筛选法--分子筛选法。与传统方法不同，分子筛选法着眼于细菌素的蛋白质或基因水平。对于蛋白质水平的分子筛选，免疫学技术是行之有效的手段，以纯品细菌素、蛋白酶水解片段或人工合成的肽片段为抗原制备的多种抗体可以灵敏地分析待测细菌素。基因水平上的筛选法则依赖于快速、灵敏的PCR的技术，目前应用PCR技术已能扩增从结构、免疫到负责细菌素加工、修饰及分泌的所有基因，缺点是无选择特性。应用PCR技术只能筛分到基因，但许多基因常是“沉默”的。另外，无论是传统筛选还是分子筛选，都是基于对已知细菌素特性的研究，也就是说，两种方法只能筛分自然界中已存在的细菌素，而不可能筛选出自然界中没有的全新细菌素。尽管如此，利用这两种方法仍可以从自然界中筛选出多种细菌素高产菌株和某些细菌素的变种或杂合子。

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