目 录
1 绪论 1
1.1 三七的化学成分 1
1.2 三七的药理作用 4
1.3 近年糖苷酶的研究进展 4
1.4 糖苷酶改造糖苷类化合物的应用 5
1.5 糖苷酶的检测方法 5
1.6 研究意义及内容 6
2 实验仪器，实验设备与试剂 6
2.1 实验仪器 6
2.2 实验设备 6
2.3 实验试剂 6
3 三七内源酶提取方法及流程 8
3.1 实验方法 8
3.2 内源酶提取方案 8
3.3 缓冲溶液的配置 10
3.4 三七新鲜药材的预处理 10
3.5 三七内源酶粗酶的提取 10
3.6 盐析 10
3.7 透析 10
3.8 内源酶的分离、纯化 10
4 三七内源酶含量测定 12
4.1 试剂的配置 12
4.2 酶蛋白含量测定 12
5 三七内源酶分子量的测定 12
5.1 Marker蛋白质的选择 13
5.2 电泳 13
5.3 显色 13
6 酶活力测定 13
6.1 PBS缓冲液配制 13
6.2 底物溶液配制 13
7 酶学性质研究 14
7.1 酶反应的最适pH值及酶旳pH稳定性 14
7.2 酶反应的最适温度及温度稳定性 15
7.3 金属离子对糖苷酶的影响 15
7.4 底物浓度对糖苷酶的 *景先生毕设|www.jxszl.com +Q: %3^5`1^9`1^6^0`7^2# 
影响 15
8 HPLC分析方法 15
9 结果与讨论 16
9.1 酶含量测定 16
9.2 酶分子量测定 18
9.3 酶活力测定 19
9.4 酶反应的影响因素 21
结论 24
致谢 25
参考文献 26
1 绪论
三七主要是指五加科人参属植物[1]三七(Panax notoginseng F.H.Chen)的干燥根及根茎，主产于四川、云南、广西等地方，多为栽培，别名参三七、田七、盘龙七、旱三七、金不换、血参等。系常用中药，被誉为“止血之最”，“外伤科圣药”。发挥主要药效作用的是皂苷类成分，苷类化合物具有良好的药理作用和多种生理活性,但是很多天然苷类化合物的分子结构并不能呈现最佳活性状态。糖苷酶可改变苷类的糖链,使其生理活性提高几十倍,甚至几百倍。因此，对三七中提取的糖苷酶的研究具有极为重要的意义。
1.1 三七的化学成分
三七含有三七皂苷约12%（苷元为人参二醇、人参三醇，如人参皂苷Rb1、Rc、Rg1，三七皂苷A、B、B1、B2、C、D、E）、黄酮苷（槲皮素及其苷）、寡肽、蛋白质、氨基酸、挥发油、甾醇、多糖、维生素、微量元素等[2]。
三七的止血成分为三七素，即β-草酰基-L-α，β-二氨基丙酸。
三七皂苷不含齐墩果酸型皂苷，原人参三型与人参二型皂苷含量为3:1，基本上与人参、西洋参相反。
三七总皂苷包含了五种成分[3]，分别为三七皂苷R1（图1）、人参皂苷Re（图2）、人参皂苷 Rb1（图3）、人参皂苷Rg1（图4）和人参皂苷Rd（图5），其中人参皂苷Rb1和人参皂苷Rg1含量较高，三七皂苷R1是总皂苷的特征化合物。
图1 三七皂苷R1结构图
图2 人参皂苷Re结构图
图3 人参皂苷 Rb1结构图
图4 人参皂苷Rg1结构图
图5 人参皂苷Rd结构图
1.2 三七的药理作用
三七味甘、微苦、性温，归肝、胃、心、小肠经，具有止血、散疲、消肿止痛等功效，主治咯血、蛆血、外伤出血、跌打损伤等[4]，三七素（三七氨酸）和三七总皂苷（PNS）发挥了主要的药效。
1.2.1 三七素的药理作用
三七素作用于血液系统，具有止血、活血化瘀，补血作用，降血脂，防止动脉粥样硬化，降血黏度，防止血栓形成，降血压。
1.2.2 三七总皂苷（PNS）的药理作用
PNS对脑血管具有保护脑组织，改善脑血循环作用；对中枢神经系统具有镇静镇痛，提高记忆力作用；对免疫系统具有增强免疫力，抗炎作用；对心血管系统具有保护心肌细胞、抗心律失常作用[5]。
1.2.3 其他药理作用
三七还具有抗纤维化、抗肿瘤、抗病毒，消除氧自由基、抗衰老抗氧化等作用[5]。
1.3 近年糖苷酶的研究进展
在所有的生物体中都存在着糖苷酶这种物质[6]。含糖化合物例如单糖苷、皂苷、糖蛋白、寡糖、多糖等通过糖苷酶的水解作用，糖苷键被水解，生成寡糖、单糖或者糖复合物的酶。糖基化合物也可以叫称之为为配糖体或者糖苷类化合物，是非糖物质与糖或糖的 *景先生毕设|www.jxszl.com +Q: %3^5`1^9`1^6^0`7^2# 
衍生物通过糖苷键连接而成的化合物，其存在的主要形式有糖蛋白、皂苷类化合物、单糖、多糖等。糖苷酶是自然界中一类重要的化合物，在食品、生物、医药等方面都有着较高的研究价值和利用价值。近年来，随着对糖苷类化合物的进一步的研究发现，许多糖苷类化合物需要经过改性以后才能够被人们更好地利用。利用糖苷酶定向改造糖基化合物的糖基成为专家研究热点[7]。本文所研究的对象糖苷酶是以三七为原料提取得到的天然糖苷酶三七皂苷糖苷酶，该酶含量少，采用生物酶提取技术，提取纯化三七皂苷糖苷酶并对获得的糖苷酶活性进行研究。
1.4 糖苷酶改造糖苷类化合物的应用
许多糖苷类化合物是天然的生物活性分子,在治疗人类疾病方面具有抗病毒、抗纤维化、抗肿瘤等药理学意义。但是，在天然野生植物中,一些糖苷类化合物因为水溶性或者脂溶性比较大,从而不能成为生物活性的最佳分子形式,定向地改造它们的糖基部分,可得到具有高活性的糖苷类化合物。酶法是目前所采用的一种有效的糖基改造方法[8]。利用糖苷酶的酶解作用即生物降解作用，将糖苷类化合物转化生成新的次级代谢产物，并以此制备有药用价值的同源化合物,另外，酶解作用还可以为天然产物活性的研究提供新的先导物,有利于研究和发现更多的生物活性物质。
糖苷类化合物和糖苷酶具有潜在的应用价值和重要的生理功能，可以应用于新药开发与生物转化，同时对天然药物的药用价值可以进行重新认识，对我国中草药的国内外发展具有重要的意义。
利用生物酶提取技术从天然药物三七中提取内源性糖苷酶，了解三七及植物内源酶的研究进展，结合生物酶的提取分离方法，建立三七中提取内源糖苷酶及皂苷成分分析方法，研究其内源糖苷酶的酶学性质，从而更好地利用酶法改造皂苷糖基，获得具有特殊活性的，药用价值更高的次级皂苷。另外，对酶学性质的研究不仅可以优化酶反应的条件,同时也为酶蛋白的功能、结构及分类的研究奠定了基础。
1.6.2 研究内容
1)查阅文献资料，设计、制定合理的实验方案；
2)设计合理的实验方法，采用离子交换树脂，亲和色谱技术提取酶；

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