目 录
1 引言 1
1.1 柴胡活性成分 1
1.2 柴胡活性成分研究进展 2
1.3 内源酶的研究进展 3
2 实验部分 4
2.1 实验仪器及试剂 4
2.2 实验方案 4
3 结果与讨论 9
3.1 内源酶蛋白含量 9
3.2 酶活力测定 10
结论 16
致谢 17
参考文献 18
1 引言
柴胡可分为植物柴胡Bupleurum chinense DC. 或狭叶柴胡B . scorzonerifolium Willd.，根据性状的不同被习惯性称作“北柴胡”和“南柴胡”。柴胡药用历史悠久为我国传统中药材，最早记录于《神农本草经》，将其归为上品，又可以叫做地熏、茈胡。柴胡嫩叶可以为菜，干枯之后可以当作柴火。质量优的柴胡一般根条粗长并且根须较少。《本草纲目》载“治阳气下陷，平肝、胆、三焦，包络相火以及头痛、眩晕、目昏诸疟，及妇人热入血室、经水不调、小儿痘疹余热、五疳羸热”等。
1.1 柴胡活性成分
柴胡皂苷（Saikosapoins a、b、c、d四种）是柴胡的主要药理活性成分，柴胡中还可以提取出柴胡甾醇、柴胡挥发油（柴胡醇等）、脂肪酸（油酸等）和多糖等。此外，柴胡中还含有黄酮、香豆素、多元醇和其他微量元素。
1.1.1 柴胡皂苷
柴胡皂苷显著的药理活性，可以用来表证发热及少阳证，肝郁气滞和气虚下陷。柴胡的开发前景较为乐观，人们对其的重视程度也比较高。柴胡皂苷的结构包含亲脂性部分苷元及酷基和亲水性糖链等。柴胡皂苷一般不能够溶于乙醚、氯仿、苯等亲脂性有机溶剂，同时也不易溶于冷乙醇。能够溶于水且易溶于热 *景先生毕设|www.jxszl.com +Q: ^3^5^1^9^1^6^0^7^2^* 
水，含水的稀醇溶液和热酒精中。柴胡皂苷易溶于含水的丁醇或戊醇。丁醇和戊醇与水互不相容，因此常用丁醇和戊醇从水中萃取溶解的柴胡皂苷，以此来达到与亲水性较强的糖、蛋白质等物质分离。当皂苷水解成为次级皂苷以后，次级皂苷在水中的溶解度降低，此时在中等极性的醇、乙酸乙酯、丙酮等中的溶解度变大。皂苷完全水解成失去糖链的苷元之后大多数难溶于水，易溶于低极性溶剂如石油醚、苯、乙醚、氯仿等。
① 张玲等[1]采用水提醇沉法提取柴胡中的柴胡皂苷a、d，通过对比试验得到最佳工艺为提取时间6小时，醇浓度为60％，此时柴胡皂苷能被完全提取。
② 李棣华等[2]采用以正交试验为基准的普通回流提取方法，柴胡皂苷成分采用高相液相色谱法进行测量，优化微波提取柴胡的各个影响因素。从而选出柴胡提取工艺的最佳条件为以8倍量50%乙醇且微波功率为800 W提取20 min，重复提取3次。结果表明微波提取的优点在于提取时间较短、效率高。
R1R2R3柴胡皂苷aOHβ-OH-Fuc 3 Glc柴胡皂苷元FOHα-OHH柴胡皂苷dOHα-OH-Fuc 3 Glc柴胡皂苷元GOHβ-OHH柴胡皂苷cHβ-OH-Fuc 3 Glc 4 Rha柴胡皂苷eHβ-OH-Fuc 3 Glc柴胡皂苷元FHβ-OH
图1 柴胡中皂苷苷元结构及主要有效成分
1.1.2 柴胡挥发油
临床上柴胡被广泛用于感冒发热，柴胡挥发油是其解热的主要有效部分之一。柴胡挥发油提取的一般方法是在常温下浸泡四个小时，以四毫升每分钟一百克生药的蒸馏速度，六倍蒸馏量，对挥发油采用提取浸泡的方法，大大提高了提取率[3]。
1.1.3 柴胡甾醇
甾醇是类固醇的一种，又可被称作固醇。在植物的根、茎、叶、果实和种子中都存在植物甾醇，植物细胞膜的组成也离不开植物甾醇，并且在所有用植物的种子提取出来的油脂中都含有甾醇。植物性甾醇在水、碱和酸中的溶解度较小，但易溶于乙醚、苯、乙酸乙酯、氯仿、石油醚等有机溶剂中。甾醇还具有抗肿瘤作用，它的药理作用为阻断致癌物诱发癌细胞形成。甾醇还可以预防心血管系统疾病。柴胡甾醇为柴胡的活性成分之一，具有抗炎解热等作用。
1.2 柴胡活性成分研究进展
目前柴胡可用于感冒发热、镇痛、镇咳、抗病原体、月经不调、疟疾、抗溃疡等作用之外，还具有调节免疫的作用，同时还具有保肝作用。由于柴胡的药用价值非常高，使得人们对其的研究不断深入。
目前科学家已经对柴胡皂苷做了许多研究，在柴胡提取物中已经分离出了九十多种皂苷类物质。在最近的十年来已经分离并鉴定出的皂苷有43个，同时也发现了许多新的皂苷类化合物。在柴胡皂苷中，柴胡皂苷a、c、d的含量最高且药理活性最为明显。现阶段检验柴胡的质量标准就是通过测定柴胡皂苷a、d的含量来评定柴胡的优劣。二十世纪九十年代以前大多是日本学者在研究柴胡皂苷，但是现阶段我国学者取得了非常大的成就。通过以往学者的研究和总结，柴胡是五环三萜类齐墩果烷型衍生物，它有七种不同类型苷元，其中包括环氧醚、同环双烯、异环双烯、十八烯型、异环双烯三十羧酸和十二烯二十八羧酸。柴胡皂苷中的糖基主要为葡萄糖、戊糖醇、木糖、鼠李糖和呋糖。柴胡皂苷的药理作用有保肝利胆、镇静镇痛、抗炎抗菌、抗肿瘤和降低血压等。
1.3 內源酶的研究进展
 *景先生毕设|www.jxszl.com +Q: ^3^5^1^9^1^6^0^7^2^* 
中药材中大多数源于植物，植物作为生命体必须在生物酶作用下方可生长发育，维持正常的植物生长代谢，因此源于植物的中药材经采摘、阴干、晾晒、切片等简单加工而制备成中药都存在有内源酶。可能最早被研究的中药材为黄芩，上世纪30 年代Miwa[4-5]发现黄芩根中含有内源酶黄芩苷酶(baicalinase)，可以水解黄芩中主要成分黄芩苷为黄芩素；1954 年，Levy[6]也从黄芩根中分离制备出黄芩苷酶，并对其水解特性深入研究，发现其对β-D-吡喃葡萄糖醛酸苷具有专一的催化水解特性；1995 年，Morimoto等[7]从黄芩植物愈伤组织培养物分离出专一性黄酮-β-吡喃葡糖糖醛酸苷酶，依次经硫酸铵盐析、DEAE-纤维素离子交换层析、羟基磷灰石层析、黄芩苷缀合葡聚糖凝胶6B层析分离纯化，SDS-PAGE 变性电泳证实分子量约为55kDa，而直接凝胶过滤层析测得的分子量约为230kDa，表明天然酶为同源四聚体，最适pH 为7.0-8.0；1995年，Ikegami等[8]直接以中国购买的中药材黄芩作为原料，分离制备出β-D-吡喃葡糖糖醛酸苷酶(β-D-glucuronidase, EC 3.2.1.31)，经DEAE-Sepharose Fast Flow 离子交换层析、PBETM94 和Polybuffer 74 等层析聚焦等分离制备出纯酶，由分子量为55kDa 的活性亚基组成，等电点为跑H5.4，最适pH 为4.7，在pH3.6-6.2 范围内均有较高的催化活性，能水解黄芩苷、汉黄芩苷中的糖苷键，但不能水解甘草甜素及其它药源苷类化合物中的糖苷键。2001 年，Zhang等[9]从新鲜人参根分离出一种独特的内源糖苷酶，可以水解人参皂苷Rg3 分子中的beta-1,2-糖苷键，而转化成人参皂苷Rh2，SDS-DAGE 变性分子量约为59kDa，最适催化温度为60 °C，最适催化酸碱性为pH5.0。
称取粉状药材10g，置于50mL离心管内，加入3倍量（v/w）4℃预冷Buffer A (30mL)，涡旋混匀，冷浸过夜，充分混合，10000rmp4℃离心15min，收集离心液，药渣再用3倍量4℃预冷Buffer A 重复处理3次，合并离心液，记为离心液-1；药渣留下备用，记为药渣-1。

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