目 录
1 引言 1
1.1 动物多糖的生物活性 1
1.2 河蚬多糖的生物活性研究 2
1.3 多糖的提取方法 2
1.4 多糖的含量测定方法 5
1.5 河蚬多糖的分离、纯化方法 5
2 实验材料与方法 8
2.1 材料 8
2.2 试剂与仪器 9
2.3 实验方法 9
3 结果与讨论 12
3.1 葡萄糖标准曲线 12
3.2料液比对提取率的影响 13
3.3 确定最超声时间 14
3.4 确定最佳酶解时间 14
3.5 确定最佳提取方案 15
3.6 正交试验结果及分析 15
3.7 确定醇沉浓度及醇沉时间 16
3.8 多糖纯化分析 17
3.8.1 NaCl浓度梯度溶液经层析柱的洗脱液 17
3.8.2红外图谱的分析 18
3.8.3核磁共振图谱的分析 20
结论 22
致谢 23
参考文献 24
1 引言
河蚬是双壳类软体动物，又称黄蚬、金蚶、扁螺等，多分布在我国的东部沿海地区。河蚬营养丰富，味道鲜美，具有很高的食用价值和保健作用。河蚬作为中药的药材，具有开胃、通乳、明目、利尿、去湿毒、治疗肝病、麻疹、退热、止咳化痰、解酒等功效。目前对河蚬功能成份的研究主要集中在蛋白和脂类物质方面,对多糖的研究还较少，而且不够深入[1]。
活性多糖是一类具有免疫调节活性的特殊生理功能的多糖，具有调节机体免疫力、 抗氧化、抗肿瘤、抗凝血、抗心脑血管疾病等多种多样的生物学功能[2] *51今日免费论文网|www.jxszl.com +Q: ^3^5`1^9`1^6^0`7^2# 
。其广泛存在于动物、植物、微生物等体内，资源极为丰富，其中动物类多糖主要包括糖原、肝素、硫酸软骨素等[3]。而河蚬多糖就是从河蚬中提取得到的动物多糖。
河蚬多糖易溶于水而不溶于醇、醚、丙酮等有机溶剂，可用95%的乙醇醇沉。脂肪溶于乙醚，用索氏提取仪脱脂。木瓜蛋白酶使结合蛋白充分酶解，便于结合蛋白的去除。超声的破碎及空化作用加速多糖溶解。透析法去除小分子杂质，Sevage法去除蛋白，层析柱进一步纯化。然后用苯酚—硫酸法测定多糖含量。
1.1 动物多糖的生物活性
1.1.1 抗肿瘤、提高免疫力
肿瘤疾病目前对人类健康和生命已构成巨大威胁，其发病率有不断增加的趋势，因此，加快抗肿瘤药物的研究己势在必行。动物活性多糖具有提高免疫力、抗肿瘤的作用，且无毒副作用，应用于肿瘤治疗将是一个新的迷人领域。许多学者认为活性多糖对集体的免疫调节功能，是其发挥抗肿瘤作用的机制之一［4］。
1.1.2 抗凝、抗血栓作用
动物多糖中的肝素和其他一些酸性粘多糖，能够有效抑制凝血蛋白酶原转变成凝血酶，具有抗凝血作用。
1.1.3 降血糖、降血脂
降血糖和降血脂[5]这两个功能是动物多糖的重要功能之一，人体内的血糖和血脂需要保持在一个动态平衡之内，否则会诱发很多心脑血管类的疾病。因此，降低血糖血脂的含量，对于人类治疗心血管疾病有重要的意义。
1.1.4 抗氧化、抗衰老作用
许多研究表明动物多糖具有抗氧化、抗衰老作用。其抗氧化机理还没有定论，但通常情况下，提高免疫功能、清除氧自由基以及抗脂质过氧化与多糖的抗衰老作用有密切关系。动物多糖有良好的清除轻自由基和超氧阴离子自由基的作用，所以其有抗氧化和抗衰老作用。
1.1.5 抗炎、抗疲劳作用
近年来，己证实具有抗疲劳作用的动物多糖有：鲍鱼性腺多糖、壳聚糖等。壳聚糖具有极良好的抗疲劳活性，能有效减轻运动机体中乳酸的堆积，并能迅速消除堆积的乳酸，增强有氧代谢耐力，提高运动能力，从而延缓机体疲劳的发生，并加快疲劳的恢复。
1.2 河蚬多糖的生物活性研究
河蚬肉营养丰富，有较丰富的氨基酸而且种类齐全，脂肪质量也比较好，含EPA和DHA，无机盐的含量也较为丰富。庄平等[17]研究了河蚬的营养成分，结果表明含有丰富的磷、铬、硒等矿物质。河蚬不仅营养丰富，而月_含有很多具有特殊生理功能的化学物质。河蚬中含有糖蛋白，其具有抗肿瘤、免疫活性、抗氧化等生物活性。对酒精性肝损伤有保护作用，但其作用机理尚未深入研究。徐明生等[18]对河蚬中具有免疫活性的糖蛋白的分离提取和结构进行了初步研究，测得蛋白含量93.22%，糖含量5.18%，并证明了河蛆糖蛋白中存在O-糖肽键，初步确定了其含有吡喃糖β型糖普键。河蚬中含有活性多糖，其具有免疫调节活性。祝雯[19]研究了河蚬多糖的分离纯化及其抗病、抗氧化等特性，并将河蚬多糖与从牡蛎、文蛤、河蚌等软体中提取出的具有与植物多糖相似生理活性的多糖类化合物相比较，认为该类多糖更具新药开发价值。
目前对河蚬多糖及其他活性成分研究较少。河蚬提取物对酒精性肝损伤具有保护作用。但对河蛆提取物的该功能作用机理目前还没有深入研究，只提出可能与其具有清除自由基作用有关。所以，明确其作用机理是进一步研究的方向之一。河蚬体内所含的金属硫蛋白等物质均能对重金属产生抑制作用。目前尚未报道，其降解作用机理尚不清楚。因此可加强该方面的研究开发。
1.3 多糖的提取方法
提取方法较多，一般有热水浸提法、碱解法、酶解法、酶碱结合等，最为常用的方法是热水浸提法，热水浸提法在提取多糖上也有不足，通常采用微波、超声及酶解等辅助手段加速多糖的浸出。
1.3.1 热水浸提法
根据活性物质的溶解特性决定活性物质的提取方法，大分子糖类物质的特点是易溶于水，因此，可以方便地用酸、碱、盐的水溶液等方法来提取。用水作为溶剂来提取多糖时，可以用热水或冷水浸提提取。一般的动物多糖大多采用热水浸提法提取，用这个方法取得的多糖水提液可以通过离心除去不溶物。
水提法的原理是动物细胞在热水中软化破裂，溢出多糖。此方法的优点是不需要使用复杂的仪器设备，成本低，操作简单，并且基本上不会破坏多糖的结构，而且没有污染。但是，这个方法的缺点是耗时长、耗能大，通常可采用微波、超声及酶解等辅助手段加速多糖的浸出［6］。
由于河蚬中含有游离的脂肪，因此在提取之前首先要进行脱脂的实验，一般选用乙醚，其原理是相似相溶。由于乙醚沸点低，所以要控制实验温度。采用索氏提取器脱脂。其原理是利用溶剂回流及虹吸原理，使固体物质连续不断地被纯溶剂萃取，既节约溶剂，萃取效率又高。但该法耗费时间长、溶剂用量大、效率不高。
脱脂后再按照一定的比例加入纯水，超声一定的时间，用1.5%木瓜蛋白酶，pH7.5，55℃水浴酶解一定时间，然后90℃水浴10min酶灭活，离心取上清液进行浓缩，加入一定量的乙醇，使乙醇浓度变为80%进行醇析，离心得到沉淀，用乙醇洗涤沉淀，低温干燥后可得到粗多糖。
在300Hz~300GHz之间的电磁波称为微波，微波提取的原理是微射线辐射于溶剂并通过细胞壁到达细胞的内部，由于溶剂及细胞液对于微波的吸收，细胞内部温度便升高，压力增大，当压力大于细胞壁的可承受的范围时，细胞壁破裂，细胞内部的有效成分便可以释放出来，溶解在溶剂中，得到粗提液。

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