摘 要本文使用国产高聚物型色谱柱，对多西环素单组分进行高效液相色谱分离的研究。对流动相中各组分对分离的影响进行了优化，得到最佳的色谱分离条件为：色谱柱：MKF-RP（200mm×4.6mmi.d., 5µm）；流动相：磷酸二氢钾2.72g，氢氧化钠0.74g，四丁基硫酸氢铵0.5g，EDTA 0.4g溶解于800mL水中，加入叔丁醇100g，用然后加水定容到1000mL，最后用1N的氢氧化钠溶液调整该溶液pH为9.5。按该条件进样多西环素标准品，结果多西环素样保留时间较药典缩短，色谱峰理论塔板数提高，理论塔板数为4036，保留时间4.63min，拖尾因子1.09，符合药典要求。在多西环素单组分分析的研究基础上，针对多西环素及其有关物质多西环素、美他环素(又称：甲烯土霉素)、土霉素的分离进行了进一步的优化。得到优化后的条件为：叔丁醇含量降为80g/L，四丁基硫酸氢铵含量为0.5g/L，流动相中EDTA含量为0.4/L，磷酸盐流动相的pH为9.5。与中国药典（2005版）相比本方法的盐浓度减少了2个百分点，保留时间缩短了10min，节约了实验时间。本色谱方法的系统适用性广，多西环素柱效不仅可达到并超过中国药典的要求，有关物质间、及与多西环素分离度都在1.5以上，且可较之中国药典与美国药典的要求各多检测出一个杂质：多西环素或土霉素。目 录
1. 绪论
1.1液相色谱简介 1
1.2液相色谱基本概论 2
1.2.1保留时间 2
1.2.2色谱峰 2
1.2.3分离度 3
1.2.4选择系数 3
1.3高效液相色谱填料 4
1.4高效液相色谱法 4
1.4.1无机质填料 4
1.4.2二氧化铝 4
1.4.3聚合物填料 5
1.5聚苯乙烯二乙烯基苯微球在HPLC中的应用 5
1.5.1反相色谱 6
1.5.2离子色谱 7
1.6聚苯乙烯基质填料的最新应用研究 8
2.实验
2.1样品溶液的配置 8
2.2 多西环
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合物填料 5
1.5聚苯乙烯二乙烯基苯微球在HPLC中的应用 5
1.5.1反相色谱 6
1.5.2离子色谱 7
1.6聚苯乙烯基质填料的最新应用研究 8
2.实验
2.1样品溶液的配置 8
2.2 多西环素有关物质归属性 8
2. 3 色谱条件的优化 9
2.3.1 流动相中叔丁醇含量对分析多西环素的影响 9
2.3.2 不同pH的磷酸盐缓冲液对分析多西环素的影响 10
2.4 优化后的多西环素分析条件和结果 10
2.5重复性 10
2.6小结 11
结论 12
参考文献 13
致谢 16
 1 绪论
近年来我国的医药市场时有医药事件发生，其主要原因之一就是药品纯度存在质量安全问题。多西环素是以发酵产生的土霉素碱原料经氯化、脱水、氢化成盐置换而得。药典中将从起始原料带入、生产过程中氢化反应不完全、反应副产物等杂质，如:多西环素 、美他环素、土霉素等统称之为有关物质。这些物质因其疗效低,药典对其有限量规定。杂质的检测方法有薄层色谱法[1]，HPLC，HPLCMS[2]等方法。目前HPLC是检测多西环素有关物质的主要方法，其所用的检测器有紫外检测器[3]，安培检测器[4]，而使用的色谱柱类型包括硅胶C18色谱柱[5]，高聚物色谱柱[6]，离子交换色谱柱[7]。
1.1 液相色谱简介
1903年，俄国植物学家茨维特（Tswett）在分离植物色素的过程中，让植物的石油醚提取液通过装有碳酸钙粉末的玻璃柱，使得植物叶中的几种色素在柱上展开了，在管内的碳酸钙上形成三种颜色的5个色带，并将这一分离方法命名为色谱法（chromatography）。这一成果发表在1906年的德国植物学会志上[8]。但是在此后的30年里，茨维特的液相色谱技术几乎无人问津。到了1931年，奥地利化学家库恩（Kuhn）[9]用液相色谱法成功地分离了胡萝卜素和叶黄素,并因此获得了诺贝尔奖。从此,许多科学家看到了这一技术的应用前景，色谱法开始为人们所重视。
液相色谱法又名固液分配色谱法，包括了离子交换色谱法和凝胶渗透色谱法等。随着气相色谱法的理论和技术被应用到液相色谱法中，填料制备技术的进步得到具有高分离效率的粒径小而均匀的球形颗粒，而化学键合型新型固定相的出现，柱填充技术的进步和高压输液泵的不断改善，使得液相色谱分析实现了高速化。在1969年，性能优良的液相色谱仪开始商品化。从此，该种分离效率高，分析速度快的液相色谱就被称为高效液相色谱法。HPLC用途广泛，适用于分析挥发性差，极性强，具有生物活性，热稳定性差的物质
1.2液相色谱的基本概论[10]
1.2.1保留时间
死时间被定义为无保留溶质通过色谱柱所需时间，通常用t0表示。ts则是溶质因与固定相作用在色谱柱中所耗费的时间，称溶质保留时间（不包括死时间），保留时间tR是指总保留时间，即：tR= t0 + ts


tR/min
图1.1 色谱图与保留时间概念
1.2.2 色谱峰的对称性
在理想状态下，色谱峰的形状可以近似地用高斯曲线描述。但是实际的色谱过程中，色谱峰都是具有一定不对称性的。不对称因子（asmetryym）来定量地表示色谱峰的不对称程度，通常将10%峰高处前半峰宽度设为a，同高度处后半峰宽度设为b，b与a的比值就定义为不对称因子As。表述公式为：As=b/a


图1.2 不对称因子的定义
1.2.3 分离度
色谱分析的目标就是要讲混合物中的各组分分离，两个相邻色谱峰的分离度定义为两峰保留时间差与两峰峰底宽平均值之商，即R=2(tR2 tR1)/（w1 +w2）, tR2和tR1分别为峰1和峰2的保留时间，w1 和w2分别为峰1和峰2的峰宽。
1.2.4 选择性系数
两组分的相对保留值被称为选择性系数α，定义为两个色谱峰真实保留时间之比。表述公式为：α=(tR2 t0)/ (tR1 t0) 选择性系数α主要是由固定相的性质决定。但是也受流动相组成的影响。
1.3高效液相色谱填料
作为高效液相色谱最核心的部分，色谱柱的性质直接影响物质的分离结果和效率。与液相色谱柱的性能相关的因素很多，基质（matrix）或者说担体、载体的化学性质、键合相（固定液）的化学性质、填料形状、大小粒度分布、碳量和键合度等等。色谱柱填料可以由基质直接构成，若依其基质材料来分，可分为两类，即、多糖类填料和高聚物填料。无机基质填料是研究和应用的主流，主要包括硅胶,以及氧化铝、氧化锆、氮化物等；多糖类填料包括瑞典Pharmacia公司Sepharose填料（琼脂糖类）及Sephadex填料（葡聚糖类）等；高聚物填料因其独有的特性，日益引起重视，正获得飞速的发展，主要包括交联聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酸酯等。
1.4高效液相色谱法
1.4.1无机基质填料
硅胶是典型的无机物基质填料，刚性大，不易变形。化学性质较
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