含厚朴制剂中抗氧化活性成分含量测定方法比较研究(附件)
目 录
1 前言 1
1.1 厚朴的抗氧化活性成分及其药理作用机制 2
1.2 厚朴抗氧化活性成分的提取与分离 3
1.2.1 厚朴酚，和厚朴酚的提取 3
1.2.2 分离 3
1.2.3 两种物质的确定 3
2 实验方法及数据 5
2.1 HPLC法测定抗氧化活性成分含量 5
2.1.1 仪器与试剂 5
2.1.2 实验方法 5
2.1.2.1 对照品溶液的制备 5
2.1.2.2 厚朴供试品溶液的制备 5
2.1.2.3 色谱条件 5
2.1.2.4 标准曲线的制备 6
2.1.2.5 精密度试验 6
2.1.2.6 重复性试验 7
2.1.2.7 稳定性试验 7
2.1.3 结果 7
2.2 UV法测定抗氧化活性成分含量 7
2.2.1 仪器与试药 7
2.2.2 实验方法 7
2.2.2.1 对照品溶液的制备 7
2.2.2.2 厚朴供试品溶液的制备 8
2.2.2.3 分离厚朴酚，和厚朴酚最大吸收峰 8
2.2.2.4 制定标准曲线 9
2.2.3 含量测量结果 10
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3 结论与讨论 11
3.1 高效液相色谱法（HPLC法） 11
3.2 紫外分光光度法（UV法） 11
3.3 结论与展望 12
参考文献 15
致 谢 17
1 前言
厚朴，是木兰科的植物，在阳光丰富，气候较为湿润的环境中生长较好，对土壤的要求比较高，在我国的四川，重庆等地生长较为适宜，属于当地的道地药材。厚朴药材味微苦，性质温和，具有多种生物活性成分，包括挥发油成分（包括愈创醇，丁香烯等30多种），酚类成分（包括厚朴酚，四氢厚朴酚，和厚朴酚等30多种）和其他成分[1]。厚朴的成分的多样性决定了其多样的药理作用，包括抑制病毒活性、杀灭肿瘤细胞，抑制杀灭细菌，减少溃疡发生，镇痛、消炎作用，肌肉松弛作用，减少氧化的发生，降低血液黏度，减少血栓发生等[2]。其中，厚朴酚，和厚朴酚是厚朴中被研究最多的成分，主要是因为这两种成分可以表示厚朴的主要生物学活性。同时这两种抗氧化的有效成分能够显著的起到多种药理作用，在临床的应用前景十分可观。
但是目前在临床上关于厚朴酚，和厚朴酚的高纯度提取还存在相对较多的技术方法问题。过去传统使用的提取厚朴酚，和厚朴酚的方法存在很多问题（包括有效成分的提取率比较低，容易破坏有效成分的质量等），使得厚朴在实际应用中的使用常存在供应不足的情况。不过，目前已经有很多针对改善厚朴有效成分提取方法的研究。根据王静霞[3]的研究表明，一共采取三种不同的提取厚朴的方法，分别是加热回流，超声和微波三种不同原理的提取方法，而不同的方法对药物不同成分的提取程度也大不相同，最终结果发现第三种提取方法的使用能够显著的提高和厚朴酚的提取率，而第一种方法能够显著提高厚朴酚的提取率。任虹[4]等人对不同的浓度的乙醇浓度的热回流提取方法对厚朴制剂中厚朴酚，和厚朴酚提取进行研究，发现70%的乙醇能够使的有效物质的提取率最高。另外，根据苏子仁[5]等人等研究表明，用二氧化碳替代水作为萃取物质，来提取乙醇，碱性物质和树脂等物质，最终结果发现提取厚朴制剂中有效成分的提取率更高，能够减少在提取过程中有效成分的破话和无效损失，更值得临床实际的应用和推广。
对于不同提取方法的评价主要基于对厚朴中抗氧化活性成分含量测定。因此为了更好的评价不同提取方法的优劣，需要准确的含量测定方法。而目前关于含厚朴制剂中抗氧化活性成分含量测定方法的研究不多，当前所用的含量测定方法主要包括高效液相色谱法和紫外分光光度法这两种方法。目前的多数研究是将其 中的一种测定方法（高效液相色谱（HPLC法），紫外分光光度法（UV法））单独进行研究，或者是是对其中的影响因素进行研究以控制因素，减少影响精确性的因素，以此改善测量方法。根据江汉美[6]等人发现， 使用HPLC法测量含厚朴制剂中的这两种物质的含量，最终结果发现经过这种方法之后测得的两种物质的含量相比较准确，并且重复率比较好而且操作起来比较简单，值得临床推广和应用。另外根据袁小芳[7]等人的研究表明，使用UV法测量含厚朴制剂的这两种成分，最终结果表明这种方法的成本比较低，同时精确度较好。因此本文比较高效液相色谱法（HPLC法）和紫外分光光度法（UV法）测量含厚朴制剂中抗氧化活性成分（厚朴酚，和厚朴酚）的含量的差别，以此更准确的评价不同提取方法，研究厚朴的临床药理作用。
1.1 厚朴的抗氧化活性成分及其药理作用机制
厚朴中所包含的化学物质种类繁多，每种化学物质都有各自独特的药理学活性，在临床上厚朴酚，和厚朴酚的药物活性较强，能够产生较强的抵抗氧化的作用，从而对多种临床常见病理变化都有一定的影响和治疗作用。厚朴酚，和厚朴酚是两个同分异构体的物质，差异在于羟基，但是这两个物质的抗氧化机制和能力却有显著差异。很多学者就厚朴酚，和厚朴酚具体的的抗氧化药理作用和机制进行了研究。根据李国章[8]等人的研究发现，和厚朴酚通过清除羟自由基及过氧化氢和活化体内抗氧化酶能够产生显著的抗氧化作用，同时还有抗菌，抗病毒，护肝，抗肿瘤等多重作用，对机体有着积极影响。张勇等人[9]研究发现，厚朴酚的抗氧化作用十分强大，抗氧化机制也比较多样，包括清除自由基，减弱脂质的过氧化作用，增加抗氧化酶的活性，因而这一作用成了其他抗内毒素，抗炎及肌肉松弛，双向调节消化系统和心血管神经系统作用的基础。而根据庞月兰[10]等人的对这两种物质的生物学活性进行的研究，表明这两种厚朴的主要抗氧化活性物质能够及其显著的加强小白鼠体内的总的超氧化物歧化酶(TSOD)水平，同时对谷胱甘肽过氧化物酶(GSHPx)和过氧化氢酶(CAT)的活性也能够显著的提高，因而能够加强生物体内总体的抗氧化能力(TAOC)。
同时厚朴酚，和厚朴酚处于不同的机体部位，对不同的抗氧化酶等活性影响程度也是不同的，并且这两种药物（厚朴酚与和厚朴酚）对不同抗氧化酶的影响作用也存在着一定的差异[11]。比如，位于肝脏中的抗氧化成分包括很多种，而不同成分和相通成分的不同剂量对这些抗氧化成分影响都有很大的不同。根据夏西超[12－13]等人的研究表明相对于和厚朴酚，厚朴酚更能够加强肝脏的过氧化氢酶的活性，能够更强的影响总抗氧化能力。但是对于肝脏的谷胱甘肽过氧化物酶来说，和厚朴酚的作用相对于厚朴酚来说则为更强更为显著。另一方面，就是厚朴中抗氧化活性成分的剂量对这些抗氧化成分的影响。根据Amorati R[1415]等人的研究发现，厚朴酚对过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化物酶的影响作用和厚朴酚的剂量呈现正性相关关系，其对CAT的影响作用程度与剂量也呈现出一种正性关系，另一方面，只有剂量较高的和厚朴酚才能加强总抗氧化能力。而在血浆中，相对于这两种物质对GSHPx的作用更为显著，而除此之外的其它抗氧化成分，比如过氧化氢酶，这两种物质的作用程度没有显著的差别[16]。另外，厚朴酚与和厚朴酚对这些抗氧化酶的影响主要通过特定抗氧化酶的基因作用实现的，因而抗氧化效果持久显著。
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