本人签名 日期 摘 要北柴胡(Bupleurum chinense DC)是我国传统的中药，是属于伞形科柴胡属植物，是药用柴胡的重要组成部分，为了探究北柴胡中类胡萝卜素中的代谢途径，所以需要克隆北柴胡八氢番茄红素脱氢酶(PDS)的基因，再进行相关的生物学分析。先设计出北柴胡的简并引物，继而获得特异性引物来进行PCR验证。结果从北柴胡的cDNA中扩增出PDS基因，命名为的Bc-PDS-1和Bc-PDS-2，并且运用系统进化树进行生物学分析，北柴胡PDS基因与进化树中的智利大麦遗传距离较近，与北柴胡PDS基因距离较远的物种为胡萝卜。该结果为北柴胡中类胡萝卜素的应用提供理论依据,对于我们理解四萜类化合物的合成进程，和基因工程来调控北柴胡药用组分的合成提供了研究的基础和参考意义。
Key words: Bupleurum chinense eight; Lycopene dehydrogenase (PDS); Gene cloning; Gene analysis目 录
1绪论 1
1.1北柴胡及PDS基因的简介 1
1.1.1北柴胡的简介 1
1.1.2柴胡克隆基因的情况 1
1.1.3 PDS基因在不同物种中的研究情况 1
1.1.4目的和意义 2
2实验内容 3
2.1材料来源及预处理 3
2.2总RNA的提取步骤 3
2.3 CDNA第一链合成 4
2.4 PCR扩增 4
2.5 PCR产物回收 6
2.6目的片段与克隆载体的连接 6
2.7重组质粒的转化与阳性克隆的筛选 7
2.8 PDS基因测序 8
2.9总DNA的提取 8
2.10引物设计与合成 9
3结果与分析 11
3.1北柴胡总RNA的提取 11
3.2 RT PCR结果 11
3.3扩增片断的回收结果 12
3.4阳性克隆的筛选 13
3.5北柴胡PDS基因测序结果及基因分析 13
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3.5.1 北柴胡PDS基因的测序结果 13
3.5.2植物PDS基因的系统进化树分析 15
4结论 16
参考文献 18
致 谢 20
1绪论
1.1北柴胡及PDS基因的简介
1.1.1北柴胡的简介
北柴胡(Bupleurum chinense DC)是我国传统的中药，散布于中国西南、中南、华北等地。柴胡是优质利用广泛生存的草本类药用植物，需求二年才能完全生长成,并且发育成成熟的植株。它会在第二年时植株成长迅速加快，并且在春季进行返青，完全的生长发育期大约为180～210天。而北柴胡的功效记载在《中华人民共和国药典》（2015年版第四部）记录它治疗感冒发热、往来寒热、头昏神眩的作用，对肝郁腹滞、子宫剥脱、月经不调等症状也有一定的医治作用[1]。
1.1.2柴胡克隆基因的情况
因为近些年关于北柴胡的使用情况越来越广泛，所以研究北柴胡基因对北柴胡的功效影响也越来越普遍，尤其是关于研究北柴胡克隆基因的情况。在徐洁森[2]的关于对细胞色素酶的克隆和分析中我们可以得到其中的细胞色素酶也参与了药效活性成分的合成，为后来的关于转基因技术的发展，提供了大量的依据和经验。在隋春[3]的北柴胡关于糖基转移酶(UGT)基因的克隆和分析得到了UGT参与了北柴胡药用成分柴胡皂苷的合成，并且说明了对药用成分的影响途径，并对北柴胡的柴胡皂苷研究提供了参考意义。而在徐洁森[4]的研究中我们得到了糖基转移酶普遍存在于生物体中，并且转化多种植物的产物，可以产生的次生代谢的产物如甾体生物碱和皂苷以及黄酮类对植物的生长和发育起着非常重要的作用。
1.1.3 PDS基因在不同物种中的研究情况
以八氢番茄红素脱氢酶为原料合成的产物应用非常广泛，在不同的植物种类中均有研究，欧阳蒲月等[5]在广藿香里对八氢番茄红素脱氢酶(PDS)进行序列分析和基因的克隆阐述了类胡萝卜素代谢路径，并证明了是广藿香药效活性的关键酶基因，若想升高其活性成分，此酶的表达是不可缺少的。崔金腾等[6]在火鹤中对八氢番茄红素脱氢酶(PDS)进行了基因的克隆和表达分析得出了PDS是否可以作为检测病毒载体，是否适合侵染植物，并且对研究火鹤这种植物的色变机制和分子育种有很强的指导意义。钟晓武等[7]对烟草里八氢番茄红素脱氢酶(PDS)进行研究和克隆与分析，得出该基因在烟草的根中无法成功表现.而是在茎和花中有所表现，也为研究烟草八氢番茄红素脱氢酶(NtPDS)的性质和活性提供了理论依据。而孙勃等[8]人关于芥蓝中PDS的克隆，并且分析其中的生物信息学,明确在时空表达形式中两基因之间的关系，为后续的转基因发展提供了借鉴。赵军林等[9]人对于甜瓜果实中的PDS克隆的表述，主要是分析甜瓜八氢番茄红素脱氢酶(CmPDS)基因在出现升高时恰好是在植株刚成熟的季节。如果果实在已经全部成熟时会呈现下降趋势。并且CmPDS基因的含有量和类胡萝卜素的含有量呈现一定的相似度，一个上升则另一个也呈升高的趋势。
1.1.4目的和意义
在自然界中的类胡萝卜素也是分布广泛的一大类色素，是植物的重要组成部分，然而它却对植物花朵的颜色起着非常重要的作用[10]。是细菌类、藻类、植物等生物的生存是不可缺少的，在光合作用中发挥作用，还有一些色素蛋白复合体中的类胡萝卜素是不能短缺的组成成分之一[11]。同时其还具有抗癌的活性[12]。然而我们所熟知的八氢番茄红素是由八氢番茄红素脱氢酶(PDS)经过第一过程催化脱氢生成 9,9二顺式 ζ 胡萝卜素，然后再由类胡萝卜素异构酶和 ζ 胡萝卜素脱氢酶生成番茄红素，进而合成最终的目的产物类胡萝卜素[13]。本论文以阐述说明北柴胡类胡萝卜素代谢途径为目标，克隆北柴胡八氢番茄红素脱氢酶的基因，并对其进行相应分析。对此基因进行深入的研究，对于我们理解四萜化合物类的生物合成进程，和基因工程来调控北柴胡药用组分的合成提供了研究的基础和参考意义。2实验内容
2.1材料来源及预处理
本实验中选取的材料是来自北京协和医学院药用植物研究所育种在实验田里的北柴胡，品种为“中柴Ⅱ号”。
实验中所需的北柴胡的幼嫩根部是经过一年生长的北柴胡，在盛花期时期所采集的，采集之后要迅速用锡箔纸包好，经过液氮冷冻之后，保存在零下80℃的超低温冰箱中，等待实验使用。
2.2总RNA的提取步骤
(1)试验使用的试剂、器材进行预处理，用来防止RNA酶的污染。
(2)试验开始之前，要用高温把玻璃和一些器皿在150℃灭菌7 hr以上。

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