本论文对威灵仙水提物的HPLC分析方法进行了研究，对波长、洗脱方法和流动相的pH进行优化，优化结果为流动相分别为0.5 %乙酸水溶液（A）-乙腈（B），B相的洗脱方法为5 %（0~5 min），5 %~18 %（5~25 min），18 %~27 %（30~45 min），流速为1 mL/min，柱温为30 °C，检测波长为280 nm，进样量20 µL，优化后所得谱图基线平稳，测得6个峰，基本实现分离。分析不同提取工艺的威灵仙提取物验证最优色谱条件的耐用性，图谱基线平稳且基本分离，HPLC分析方法优化成功。关键词 威灵仙水提物，HPLC分析方法优化，波长优化，洗脱方法，流动相pH
目 录
1 引言 1
1.1 威灵仙的研究背景 1
1.2 威灵仙中的化学成分 1
1.3 HPLC在中药分析中的应用 2
1.4 研究的目的与意义 3
2 实验试剂耗材及设备 4
2.1 试剂耗材 4
2.2 设备 4
3 HPLC分析方法优化 4
3.1 样品制备 4
3.2 流动相选择 4
3.3 柱温选择 5
3.4 波长优化 5
3.5 流动相洗脱方法优化 6
3.6 流动相的pH值优化 7
4 方法耐用性考察 8
结论 10
致谢 11
参考文献 12
1 引言
1.1 威灵仙的研究背景
威灵仙为常用中药，别名铁脚威灵仙、百条根、老虎须、铁扫帚，有祛风除湿，通络止痛的功效。其原植物来源为毛莨科植物威灵仙Clematis chinensis Osbeck.、棉团铁线莲Clematis hexapetala Pall.、东北铁线莲Clematis manshurica Rupr.的干燥根及根茎。威灵仙的化学成分十分复杂，有着广泛的药理作用。迄今为止，已从威灵仙中分离出多种成分，并且有研究证明其中部分成分为有效成分。近年来关于威灵仙总皂苷治疗关节炎的研究和水提取物对病症作用机制和疗效比较多，关于化学成分的大部分是威灵仙化学成分 *景先生毕设|www.jxszl.com +Q: ^351916072* 
研究进展这类总结性的文献。
1.2 威灵仙中的化学成分
迄今为止，人们已经从威灵仙中分离出了皂苷类化合物、黄酮类化合物、挥发油等多种化学成分。
1.2.1 皂苷类化合物
威灵仙根部中发现很多种类的皂苷或次皂苷，而茎叶中的含量较少，这种皂苷大多是三萜皂苷[1]，主要是以齐墩果酸和常春藤皂苷元为皂苷的苷元，齐墩果酸常用于威灵仙药材的理化鉴别[2]。苷元的3位和28位连接有糖，主要是鼠李糖、核糖、葡萄糖和阿拉伯糖等，并且大多数皂苷是双糖链苷。Shao BP[3]等通过醇提法从威灵仙根部中分离得到11种三萜皂苷，分别是saponins CP4、CP6、CP7、CP8、CP10 , clematichinenoside A~B，huzhongoside B、D，kizuta saponin K3。其中clematichinenoside A~B为新皂苷。Mimaki Y[4]等从威灵仙中分离得到8个三萜皂苷，其中有5个新皂苷且皂苷的苷元是以齐墩果酸为母核，另外3个皂苷为已知皂苷并对其结构进行了鉴定。这些皂苷化合物显示有抑制肿瘤细胞的作用。Shi SP[5]等从东北铁线莲中分离得到4个成分为新化合物的三萜皂苷，并且这些皂苷可明显抑制COX2。
1.2.2 黄酮类化合物
董彩霞[6]等用乙醇回流提取威灵仙，通过柱色谱和高效液相色谱等来分离纯化得到了12个黄酮化合物，根据波谱数据结合理化性质鉴定了这些化合物，分别有（3,5,6,7,8,3,4heptamethoxyflavone）、5，7，4′三羟基3′甲氧基黄酮醇7OαL鼠李糖(1→6)βD葡萄糖苷、川陈皮素、甘草素、甘草素7OβD吡喃葡萄糖苷、橙皮素、柑桔黄素、芒柄花素、大豆素、鸢尾苷、染料木素和6hydroxybiochain A。
1.2.3 挥发油
威灵仙中所含挥发性成分比较多，其中正十六烷酸（棕榈酸）和（Z,Z）9,12十八碳烯酸是威灵仙3种植物中中所共同含有且占的比列达到50%左右[7]。郗瑞云等[8]人利用水蒸气蒸馏法分别提取威灵仙3种植物，再用醋酸乙酯萃取法萃取，比较威灵仙3种植物中所含的挥发性成分，发现其共有成分为亚油酸、棕榈酸和松油醇。此外，威灵仙中鉴定出的挥发性化学成份还有2甲氧基苯酚、辛酸、4(1甲基乙基 )苯甲醇、2甲氧基4乙烯基苯酚等。何明等[9]采用分别采用水蒸汽蒸馏法和超临界CO2流体萃取技术分别得到威灵仙的挥发性成分，利用GCMS联用技术研究鉴定。由水蒸气蒸馏提取的威灵仙提取物中分离出28个挥发性成分，鉴定了25个，含量较多的有棕榈酸、亚油酸、和邻苯二甲酸酯等；超临界CO2流体萃取技术提取物中分离出23种挥发性成分并全部鉴定棕榈酸、亚油酸和亚油酸乙酯含量较多。
1.2.4 其他
宋文猗等[10]采用原子吸收分光光度法测定威灵仙，发现威灵仙含有六种含量丰富的微量元素Zn、Ca、Fe、Ni、Mg、Cu，其中含量最高的是Fe和Zn。最早从威灵仙中分离出来的有效成分是原白头翁素、白头翁素[11]。
1.3 HPLC在中药分析中的应用
中药的化学成分复杂且含杂质较多，常用的薄层色谱（TLC）等方法的精密度、准确度、灵敏度、重现性差，分离分析中药中的化学成分比较困难。高效液相色谱具有高压、高速、高效、高灵敏度等特点，成为中药研究中的最重要的分析方法。目前高效液相色谱已经广泛应用于生物碱、皂苷、黄酮、蒽醌、香豆素等各种中药有效成分的测定[12]。
1.3.1 HPLC用于分离检测皂苷类化合物
高效液相色谱蒸发光散射检测器（HPLCELSD）或高效液相色谱质谱联用(HPLCMS)，能够分离检测没有紫外吸收或仅为紫外末端吸收的物质。皂苷类化合物无紫外吸收或仅为末端吸收，HPLCMS或HPLCELSD能够对其不经衍生进行检测。赵亮[13]等采用高效液相色谱法测定人参中8种主要皂苷类成分的含量，采用Agilent Zorbax SB C18色谱柱（3.0 mm×100 mm，3.5 µm），流动相为乙腈（A）和水（B），梯度洗脱；A相随时间的变化为18%~20%（0~14 min），20%~29%（14~20 min），29%（20~25 min）29%~37%(25~34 min)，37%~55%(34~40 min)；流速0.6 mL/min；检测波长203 nm；柱温25 ℃；进样量10 µl。结果8种人参皂苷Rb1、Rb2、Rb3、Rc、Rd、Re、Rf、Rg1在35 min内基线分离，线性良好。

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