本实验主要分析关于雷公藤红素作用于人结肠癌细胞(SW620)后蛋白质的差异表达，探讨雷公藤红素治疗结肠癌的作用机制。采用雷公藤红素浓度梯度为1 mM提取SW620细胞总蛋白，采用同位素标记的同位素相对绝对定量(Tandem Mass Tag , TMT)技术和纳升液相色谱-串联质谱(Nano LC-MS/MS)结合定量蛋白质组学方法对差异表达的蛋白进行分析鉴定，利用生物信息学的相关知识分析蛋白质的差异表达功能。结果证实，雷公藤红素对SW620细胞具有细胞毒性作用，并能影响其多种生物途径，从而起到抗肿瘤的作用。
目录
1. 前言 7
1.1 雷公藤红素 7
1.2 TMT技术 7
2. 材料与方法 10
2.1 试剂和材料 10
2.2 仪器 10
2.3 常用试剂配制 11
2.4 实验方法 11
2.4.1 人结肠癌细胞SW620的培育 11
2.4.2 TMT标记Nano LCMS /MS分析 12
2.4.3 蛋白还原、酶解、高pH 反相分级 12
2.4.4 纳升液相色谱QE质谱仪分析蛋白质 13
2.4.5 数据分析 13
2.4.6 生物信息学进行蛋白差异表达分析 13
2.4.7 数据统计 14
3. 实验结果 15
3.1 雷公藤红素对人结肠癌细胞SW620的影响 15
3.2 TMT技术标记联合Nano LCMS /MS分析 15
3.3 差异蛋白GO功能注释 17
3.4 分子功能(Molecular Function，MF) 17
3.5 生物学过程(Biological Process，BP) 18
3.6 细胞成分(Cellular Component，BP) 19
3.7 信号通路 21
4. 分析与讨论 24
4.1 分析 24
4.2 讨论 26
5. 结论 28
参考文献 29
致谢 31
1.前言 *景先生毕设|www.jxszl.com +Q: ^351916072^ 

1.1 雷公藤红素
雷公藤红素是第一个从雷公藤中分离出来的化合物。医学研究从20世纪80年代开始，然后上升。在21世纪之后，开始更快的研究。它是最受研究的活性成分之一。雷公藤红素的药物作用主要用于消炎、抗氧化、保护神经元、抗肿瘤和治疗代谢疾病[1]。近年来的研究表明，雷公藤红素的作用有许多靶点特征，目前发现和报告了对许多不同的蛋白质的影响，约460种。我们发现直接结合雷公藤红素的蛋白靶点，包括热休克蛋白90 (HSP90)，微管蛋白(Tubulin)，淋巴细胞抗原96 (MD2)等[2]。关于这些靶点的研究表明，至少有两种与蛋白质相互作用的方法：一种是对蛋白质上自由巯基的加成的化学反应，形成共价键。另一种是入侵形成蛋白质的超疏水区域。雷公藤红素影响的蛋白质集中在多种信号通路，如泛素添加/蛋白酶通路、HSP90/HSF1/HSP70/激酶通路等[3]。
关于雷公藤红素的进一步研究值得注意：(1)雷公藤红素对动物全身的影响。到目前为止，还没有证据证实雷公藤红素对全身主要器官和组织的长期影响。在了解了雷公藤红素对病理细胞和组织的影响后，得出不同剂量的雷公藤红素有不同的作用。在1到10 mM，通过诱导细胞凋亡来防止细胞周期进展，从而起到抗肿瘤的作用。在100 nM到1 mM之间，细胞周期的关闭过程，热休克诱导和防止细胞因子的产生，都是一种抗炎症作用，可以治疗自身免疫性疾病、代谢性疾病和神经元退化。(2)通过实验分析，尽管做了一些研究，雷公藤红素可能在较低剂量有其他影响，而不同剂量的雷公藤红素可能对正常组织有不同的影响。这项研究是雷公藤红素的临床转变的基础。(3)雷公藤红素的新研究：通过使用KEGG信号通路的技术，对雷公藤红素的蛋白质进行了分析，研究得出的结论是雷公藤红素也可能对传染性疾病有重大的治疗作用[4]。(4)研究雷公藤红素的直接目标：目前已经发现了一些直接的雷公藤红素效应的目标，但可能仍然有一些直接的目标在未被发现的细胞内。仅仅在于在功能和生物信息学方面，雷公藤红素研究的作用从靶点出发，但最有力的可以证实雷公藤红素与靶点研究之间的结构力学，特别是晶体结构的没有。(5)雷公藤有效成分中的其他成分，与雷公藤红素之间相互影响的关系仍然需要研究[5]。
1.2 TMT技术
TMT技术是一种新的基于MS / MS的同位素分析策略标签，称为“串联质量签”
(Tandem Mass Tag Sign, TMTs)，描述了肽和蛋白质的精确定量。新标签的设计是为了确保用不同TMTs标记的相同肽段在所有分离过程中都能完全融合。这些标签需要使用串联质谱的新型定量分析方法。新的标记和分析方法使得从不同样品中提取肽的相对丰度比其他方法更容易和准确。新TMTs允许使用基于碰撞诱导离解(Collision Induced Dissociation, CID)的分析方法同时测定肽对的身份和相对丰度。在MS/MS模式下使用新标签进行的相对丰度测量是准确和敏感的。与MS模式测量相比，基于MS/MS的检测方法具有很高的可信度。新的标签应该适用于多种肽分离方法。
研究发现了TMT标签在同时鉴定和定量复杂蛋白混合物成分方面的优势。TMT标签克服了与前面描述的同位素标记技术相关的许多问题。传统的氘标记方法存在着用不同氘同位素标记的相同肽段在色谱分离过程中不溶出的问题。虽然这个问题可以用C13来解决，但是和新的ICAT试剂一样，同位素标记肽的不同荷电状态也存在问题，因为与传统同位素标记对应肽的质量差异会随着肽的荷电状态而变化[8]。
这两个问题都给肽对的精确定量和鉴定带来了困难，这些问题限制了任何仪器可用于给定的标记肽的产量测定。相比之下，对TMT标签进行CID分析可以得到可靠的TMT片段离子，这些离子反映了其来源肽段的相对丰度。通过基于MS/MS的色谱分离中洗脱的离子的扫描，TMT可以很容易地识别被标记的物种，允许忽略未标记的物质。这些标记在大的动态范围内显示出一致的特性，并且标记肽的检测灵敏度不亚于其他标签的程序。此外，TMT标记肽的荷电状态不影响肽对丰度比的检测能力[9]。

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