摘 要纳豆激酶(Nattokinase，NK)是由日本学者从大豆发酵之后的纳豆中分离出来的一种由Bacillus subtilis natto分泌的碱性丝氨酸蛋白酶。将其命名为纳豆激酶，实验研究证明纳豆激酶具有溶解血栓中的不溶性纤维蛋白能力，且口服之后易被机体吸收，不易被代谢掉、对身体无生理毒性。是一种具有广阔前景的溶栓类药物。本论文主要研究的结果如下1. 通过以B. subtilis natto基因组为模板，PCR体外扩增得到NK基因片段，将NK基因与质粒pMD19用T4连接酶连接，得到重组质粒pMD19-NK，并通过热激法将其导入Escherichia coli DH5α中，成功构建重组菌株E. coli DH5α-pMD19-NK。2. 通过BamH I 和 Xoh I限制性内切酶分别对pMD19-NK和穿梭质粒pMA5-CSCE酶切，胶回收NK基因和线性化的pMA5，再用T4连接酶将NK和pMA5连接，成功构建大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭质粒pMA5-NK，并通过化学转化法将其导入B. subtilis WB800中，成功构建重组菌株B. subtilis WB800-pMA5-NK。3.得到重组菌B. subtilis WB800-pMA5-NK对NK的表达曲线。
目录
第一章 绪论 1
1.1研究背景 1
1.2研究现状 1
1.3纳豆激酶 2
1.3.1纳豆激酶的分子基因结构 2
1.3.2纳豆激酶的理化性质 3
1.3.3纳豆激酶的酶活力测定 3
1.4本课题研究的目的和意义 4
第二章 实验方法 5
2.1 NK基因的扩增 5
2.2构建重组菌株Escherichia coli DH5αpMD19NK 6
2.3构建重组菌株Bacillus subtilis WB800pMA5NK 6
2.4重组菌株Bacillus subtilis WB800pMA5NK的表达 8
2.5纳豆激酶的酶活以及含量的测定 9
2.5.1 B. subtilis WB800pMA5NK和B. subtilis natto发酵以及产酶曲线绘制 9
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/> 2.5.2纤维蛋白平板的制备 9
2.5.3标准曲线的绘制 9
2.5.4纳豆激酶粗酶液的酶活力测定 10
2.5.5 发酵液中纳豆激酶蛋白含量的测定 10
第三章 结果与分析 11
3.1 Escherichia coli DH5αpMD19NK的构建与鉴定 11
3.1.1 纳豆激酶基因PCR温度优化 11
3.2 Bacillus subtilis WB800pMA5NK的构建与鉴定 12
3.2.1 pMA5NK图谱 12
3.2.2 SDSPAGE凝胶电泳 13
3.2.3 产酶曲线的绘制 14
3.3 纳豆激酶的酶活力测定以及产酶量测定 16
3.3.1 纳豆激酶酶活标准曲线的绘制 16
3.3.2 纳豆激酶蛋白含量测定 17
第四章 结论与展望 19
4.1结论 19
4.2展望 19
参考文献 20
附录 21
致谢 26
第一章 绪论
1.1研究背景
据世界卫生组织统计数据表明，全球死亡率最高的疾病不是癌症，而是心血管疾病。血栓便是心血管疾病中最主要的一类心血管疾病。人体血液中存在纤溶系统和凝血系统，机体在正常的状态下这两种系统是相互制约的[1]。当机体纤溶系统或凝血系统出现病理状况时，身体就会出现病变。如果是纤溶系统病变，会导致血栓的形成。如果是凝血系统病变，机体受伤时就会出现出血不止。在我国大约有300万患者患有不同程度的血栓，需要进行药物治疗，因此研究预防与治疗血栓疾病的药物具有广阔的市场前景和价值。
针对于血栓疾病的治疗方法，目前治疗血栓主要有三种方法：第一种是血栓严重时借助外科手术进行清除，或者用人工合成的血管替代阻塞严重的部位；第二种是使用溶栓类的药物，比如蚓激酶、尿激酶等进行治疗，在血栓不太严重的时候使用药物治疗或者辅助治疗，是一种主要的方法；第三种是服用抗凝药物进行预防性的治疗，该治疗方法通常是与其他的方法同时进行使用[2]。
纳豆激酶自1987年由日本研究学者须见洋行发现并证明其具有溶解血栓的作用以来，便一直作为各国科学家研究其作为溶栓药物的热点[3]。纳豆激酶溶解血栓的作用机制有两个途径，一个是直接溶解血栓，该作用机制和纤溶酶的作用机制类似，通过酶结合位点与血栓的纤维基质结合，分解血栓；另外作用机制是间接的溶解血栓，和尿激酶作用机制相似通过激活纤溶酶原产生纤溶酶溶解血栓。根据溶解血栓的两个途径可以将溶解血栓的药物分为两类。一类药物是同纤溶酶一样直接溶解血栓的药物为直接溶栓药，另一类是相当于纤溶酶原激活剂，是简介溶栓药，经人体吸收之后激活纤溶酶原从而溶解血栓[4]。除此之外，纳豆激酶不仅能够作为血栓的预防与治疗药物，而且还能治疗慢性鼻窦炎伴鼻息肉[5]。纳豆激酶的诸多疗效，说明研究纳豆激酶具有巨大的医疗价值。
1.2研究现状
产纳豆激酶的菌株，比如Bacillus subtilis natto和Bacillus licheniformis的野生型菌株在发酵之后，发酵液中纳豆激酶的含量以及活性较低，工业生产价值不大。随着科学技术的发展，通过基因工程技术进行菌种的改造，得到纳豆激酶高产菌株成为一种可能。比如通过信号肽筛选实验，工程菌株比出发菌株的表达量提高了1.5倍[6]。有利用枯草芽孢杆菌表达系统中密码子的偏好性，来构建合适的重组菌株，构建好的工程菌株纳豆激酶的产量及酶活比出发菌株提高3.9倍[7]。
目前，日本韩国等一些国家已经开发出了纳豆激酶的片剂、胶囊制剂、食品添加剂。并且在医疗保健行业的市场份额每年在逐步的增大，在中国也有部分企业推出了纳豆激酶产品，面向市场。纳豆激酶的生产主要是通过微生物发酵来生产。使用基因改造技术、微生物培养技术来进行工厂化生产。有构建基因工程菌进行生产，也有对B. subtilis natto发酵培养基进行探索优化，来提高发酵液中纳豆激酶的含量及活性[8]。还有学者通过研究枯草芽孢杆菌蛋白酶的胞外表达中分子伴侣在穿膜运动的作用，从而使大肠杆菌工程菌产生的纳豆激酶具有溶纤活性[9]。
大豆发酵成为纳豆的过程中，由于大豆中的蛋白质被微生物分解为氨基酸，因此纳豆有一股氨臭味。中国消费者对于饮食讲究色香味俱全，纳豆由于发酵的气味致使消费者难以接受纳豆这种产品，这成为纳豆产品在国内打不开的原因[10]。有相关学者发表的文献报道，将纳豆激酶干粉与其它的谷物粉混合成营养品，受到了不少消费者的喜爱。其次国家对此类保健营养产品的支持政策比较少，导致纳豆激酶类产品在市场上的竞争力比较小，从而生产的营养品质量良莠不齐。在最近的几年中，经济文化水平逐渐提高，消费者越来越注重饮食上的均衡。同时科学技术的进步提高了纳豆激酶产品的质量、气味、色泽。纳豆以及纳豆激酶产品慢慢被消费者认可并受到了广泛的欢迎。

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