摘 要本实验以鱼腥草为研究对象，采用匀浆法从鱼腥草根、茎、叶中分离内生放线菌，将分离得到的内生放线菌进行发酵培养，测定放线菌的发酵液对猕猴桃溃疡菌、苹果腐烂病菌、油菜菌核病菌、小麦赤霉菌、番茄早疫病菌和玉米大斑病菌6种不同植物病原菌的抑制性。结果表明：从新鲜的鱼腥草样品中分离得到7株内生放线菌，其中编号为003的内生放线菌的发酵液对猕猴桃溃疡菌有很好的抑菌效果，编号为002的内生放线菌的发酵液对苹果腐烂菌存在微弱的抑制性。目 录
1 综述
1.1 内生菌的概述 1
1.2 内生放线菌的研究进展 1
1.3 内生放线菌次级代谢产物的研究 2
1.3.1 植物内生放线次级代谢产物的多样性 2
1.4 鱼腥草的概述 3
1.4.1 鱼腥草的食用价值 3
1.4.2 鱼腥草的药用价值 4
1.4.3 鱼腥草的化学成分 5
1.5 国内外关于鱼腥草内生放线菌的研究现状和发展趋势 5
1.6 研究目的和意义 6
2 实验内容
2.1 实验材料 7
2.1.1 材料、仪器、试剂及病原菌 7
2.1.2 培养基及主要溶液的配制 7
2.2 鱼腥草内生放线菌进行分离纯化 8
2.2.1 对鱼腥草的消毒前处理 8
2.2.2 鱼腥草最佳消毒时间的确定 8
2.2.3 用匀浆法对鱼腥草内生放线菌进行分离纯化 8
2.3 纯化所得内生放线菌的抑菌活性的测定 9
2.3.1 发酵液的制备 9
2.3.2 发酵液抑菌活性的测定 9
2.4 结果与分析 9
2.4.1 鱼腥草最佳消毒时间 9
2.4.2 鱼腥草内生放线菌的分离结果 10
2.4.3 抑菌活性的测定结果 11
总结 13
参考文献 14
致谢 16
1 综述
1.1 内生菌的概述
内生菌是存在于地球上的一类最为丰富的微生物资源，它生长快，可迅速达到预期的目的数量，具有其他动植物不可比拟
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鱼腥草最佳消毒时间 9
2.4.2 鱼腥草内生放线菌的分离结果 10
2.4.3 抑菌活性的测定结果 11
总结 13
参考文献 14
致谢 16
1 综述
1.1 内生菌的概述
内生菌是存在于地球上的一类最为丰富的微生物资源，它生长快，可迅速达到预期的目的数量，具有其他动植物不可比拟的优势。内生菌和它们的代谢产物可以使宿主植物更好地适应各种环境，同时维持整个生态系统的平衡。内生菌在组织中会与病原菌争夺营养物质，在互相争夺中，它们会逐渐形成敌对关系，最终使病原菌在缺乏营养供给的情况下消亡。随着科学技术的飞速发展，新微生物已成为药物来源的有效途径。
内生菌(endophyte)的概念最早是1866年由De Bary提出的，但目前被广泛接受并应用的定义是由Stone[1]等提出的——他们将植物内生菌定义为：植物内生菌是指被它们所感染的宿主植物不会或暂时不会表现出明显的致病症状，能够直接在植物组织内观察到或者是从经过严格消毒的植物组织中分离得到，由于它们生活在没有外在感染症状的健康的植物组织内部，所以它们的存在长期以来被人们忽略，在当时并没有引起人们的广泛关注，直到20世纪30年代，发现了造成牲畜中毒并且引发牧草大规模损失的内生真菌后，内生菌的研究才逐步深入地兴起[2]，主要包括内生细菌、内生真菌和内生放线菌。
1.2 内生放线菌的研究进展
放线菌（endophytic actinomycetes）是一种广泛分布于自然界中的细菌的特殊类型，它的得名起因于其菌落中的菌丝常从一个中心向四周辐射状生长，主要存在于土壤、空气和水中，特别是在含中性偏碱性、水量低、有机质丰富的土壤中数量最多[4]。
放线菌是一类存在于土壤中的重要的原核生物，它是一类与人类关系极其密切的微生物，在自然界的各种环境中分布广，种类多，具有分支状菌丝，是一类具有重要应用和开发潜力的微生物资源。大多数抗菌素和酶抑制剂都来自放线菌[3]，其中广泛应用于市场和临床的800个微生物的天然化合物中，源自放线菌的抗生素占整个抗生素的67%，大约有数十种广泛应用于临床和农药生产领域，如土霉素、链霉素、卡那霉素等。在发现的来源于微生物的新生物活性物质中，45%以上都是由放线菌产生的[5]。放线菌属于革兰氏阳性细菌，属细菌域放线菌门。1944年美国人发现了链霉菌，它是第一次应用于临床的，由放线菌产生的抗生素。我们所熟悉的弗兰克氏菌（Frankia），它可以与多种非豆科植物共生，生长出瘤，固定空气中大量的氮元素，成为可供植物利用的氮源，最终被植物自身所利用。它可以称得上是最经济、最环保的氮肥，在农业上有着非常乐观的应用前景。
近年来，越来越多的微生物先后从内生菌中分离出来，它们多具有抗肿瘤、抗菌、抗虫害和促进生物生长的特点。
在临床应用方面，内生放线菌可产生多种具有细胞毒性的抗肿瘤化合物和多种具有抗病毒、抗菌活性的新抗生素，对有寄生虫、耐药性的病原菌有很好的抑制作用，对能引起人类疟疾的疟原虫也有抑制作用[5]，植物的内生放线菌能够产生一些酶类，Quecine等[6]发现大多数测试的内生链霉菌都具有几丁质酶的活性，几丁质酶是一类水解酶，它可以降解菌株细胞壁上的致病因子—霉素，继而抑制多种病原菌，以达到防治疾病的目的。内生菌可产生抗癌、抗肿瘤的活性物质，例如1993年美国学者Stierle等第一次从短叶紫杉树皮中分离出一株能产生紫杉醇 (Taxol)和其他紫杉烷类化合物的内生真菌新物种——安德紫杉菌(Taxomyces and reanae)，这一重大发现不仅有效地解决了紫杉醇药源危机，而且还提供了新的制药途径，大大刺激了内生菌领域的研究，从而掀起了从药用植物中分离内生菌的新热潮[7]。
生物防治方面，由内生菌产生的一系列的抗菌剂、杀虫剂，是植物的保护剂和增产剂，它们可以有效地防治宿主病害，提高植物产品的产量和品质。
植物生长方面，大多数内生放线菌在促进植物生长的同时还可提高植物的抗逆性，但一些内生放线菌也会对植物的生长产生抑制作用，例如Furumai等[8]和Igarashi等[9]在分离来自华东山柳根部的吸水链霉菌(streptomyces hygroscopicus)的代谢物中发现了一种新的花粉管生长抑制剂clethramycin，它可以通过抑制促进花粉萌发的MAP激酶的活性，从而达到抑制植物的生长发育的目的。
1.3 内生放线菌次级代谢产物的研究
1.3.1 植物内生放线次级代谢产物的多样性
植物内生放线菌相对其他来源的微生物本身就是一种天然的选择系统，它通过分泌各种结构不同的次级代谢产物，以此来提高对宿主的耐受性，因此它能够降低微生物产生的活性物质对于高等植物的毒性，同时植物内生菌一直被认为是有功能的代谢产物的来源。
植物内生放线菌次级代谢产物的多样性主要体现在化学结构和生物活性方面，在生物活性方面，主要有抗菌、抗病毒、降糖、抗肿瘤、免疫抑制剂等功效。还有些广谱抗生素具有多种生物活性。
1.4 鱼腥草的概述
鱼腥草（Houttuynia cordata Thunb），《名医别录》中有记载称其：“生湿地，山谷阴处亦能蔓生，叶如荞麦而肥，茎紫赤色，江左人好生食，关中谓之菹菜，叶有腥气，俗称鱼腥草”。它广泛生长在我国中部、东南及西南方的各个省区，又名折耳根、截儿根、猪鼻拱、蕺菜，客家话称之狗贴耳，为三白草科多年生草本植物蕺菜，它的药用部位为干燥地上部分和新鲜的全草，性辛，微寒，具有清热解毒、消痈排脓、利尿涌淋的功效[10]。喜欢生活在潮湿阴暗的环境，忌干旱，耐涝，耐阴，怕强光，最宜生长在肥沃的砂质壤土及腐殖质壤土中，而不适合在粘土和碱性土壤中生存。它不会与其他作物争地，可大量栽培。具有抗菌、抗病毒、抗炎症、增强机体免疫功能、抗过敏、平喘、镇咳、利尿等药理作用，也有报道称，鱼腥草曾在抗击非典等重大疫情中发挥过重要的作用。鱼腥草作为人们常用的野生蔬菜之一，它还具有很高的营养价值，它的营养成分主要有蛋白质、油脂、维生素、粗纤维、多种氨基酸等，被国家卫生部门确定为“既是药品，又是食品”的极具开发潜力的资源之一，它也因此得到广泛的种植。其实早在两千多年前鱼腥草就作为野菜佐食。据说，在春秋时代越王勾践卧薪尝胆、励精图治时，也曾带领众人择蕺菜(鱼腥草)而食之，以充饥废荒；魏晋时起，蕺菜便正式作为药用，以“鱼腥草
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