目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法1
1.1植物材料1
1.2培养条件1
1.3试剂1
1.4方法1
1.4.1苦参无菌快繁体系优化1
1.4.2同源四倍体的诱导2
1.4.3同源四倍体的鉴定2
2 结果与分析3
2.1快繁及生根培养基的优化3
2.2同源四倍体的离体诱导4
2.3同源四倍体的鉴定4
2.3.1形态学鉴定5
2.3.2细胞学鉴定5
3 讨论6
致谢7
参考文献7
Abstract7
引言
学生 李颖硕
[摘要] [目的]本实验的目的是解决苦参资源可持续发展与种质创新问题。[方法]通过离体诱导的方式进行苦参同源四倍体的种质创制，采用随机区组实验设计进行了苦参培养基优化，以茎尖为外源体进行四倍体离体诱导，采用形态学鉴定、观察气孔和染色体鉴定方法鉴定同源四倍体植株。[结果]实验显示最佳增殖培养基：MS + 6BA 1.0 mg.L1+ NAA 0.2 mg.L1；最佳生根培养基：1/2MS+ NAA 0.5 mg.L1 ；0.2%秋水仙碱处理24 h条件下苦参多倍体诱导率最高，达到19.9%。[结论]实验共获得19个苦参同源四倍体株系，为进一步开展苦参多倍体育种提供了的实验材料。
[关键词] 苦参；秋水仙素；同源四倍体
药用植物是指具有防治疾病的生物活性化合物，且有一定医疗用途的植物。而药用植物多倍体诱导是一种人为使植物染色体加倍形成多倍体从而获得良性状的方法[1]。药用植物加倍后会出现植株巨大化、抗逆性强、药用活性成分含量增加等特点，如由日本薄荷和库叶薄荷诱导的异源四倍体具抗寒、抗粉霉菌等优点[2]；白术同源四倍体的过氧化物酶含量高于二倍体植株[3]；杭白芷多倍体的药用成分欧前胡素的含量比原植物高出近2倍[4]。因此通过多倍体育种的方法选育药用植物优良品种具有重要的意义。
苦参[Soph
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ora flavescens Ait]为豆科苦参属多年生落叶半灌木植物，常被称为苦槐、地槐、虎麻和川参[5]。苦参含多种生物碱、脂肪酸、挥发油、还含黄酮类化合物，具有抗乙肝病毒[6]、抗肿瘤、抗过敏、升白细胞、体内外抗菌、护肤美容、平喘祛痰、免疫抑制等作用[78]，并且对实验性胃粘膜损伤有保护作用[9]。除药用外，苦参在农业上有除虫，防治牲畜病害的作用；在美容护肤上有预防皮肤疾病的作用；在新农药的研究前景上，是新农药的先导化合物[10]，研发出的农药产品具有药效长、稳定、难产生抗药性的特点，同时还能增加农作物的产量。苦参生药资源大多以采挖野生植物为主，长期超限量采挖造成野生资源日益枯竭。近年来，一些地区相继开展了人工苦参栽培，但大部分以采集野生种子繁殖为主，且能采集的苦参种子量非常有限，加之苦参种子种皮硬，发芽率低，种苗严重不足已成为制约苦参规模化栽培的瓶颈。人工多倍体育种是植物良种选育的方法之一，在作物遗传改良及新品种选育中得到广泛应用。
1 材料与方法
1.1 材料
苦参种子，经大学园艺学院中药材科学系向增旭副教授鉴定为豆科苦参属苦参（Sophora flavescens Ait）的种子。在无菌操作台上，将机械损伤处理的苦参种子经无菌水冲洗、酒精、氯化汞处理后播撒到MS培养基表面上，（25±2）℃，光照强度1500～2000 lx的无菌环境中诱导培养35 d，选择大小一致、分化稳定的茎尖作为实验材料。
1.2 培养条件
光照条件1500～2000 lx,光照时间12 h；培养温度(25±2)℃；MS为基本培养基，外加蔗糖(32±1) g，琼脂(6.9±0.1) g，调整 pH值为5.8。
1.3 培养试剂
琼脂，蔗糖，大量元素，微量元素，有机化合物，铁盐，秋水仙素，卡诺氏固定液（无水乙醇：冰醋酸=3:1），乙醇，解离液（1 mg.L1 的盐酸），染色液（苯酚品红染液）。
1.4 培养方法
1.4.1 苦参无菌快繁体系优化 在温度为(25±2) ℃，光照强度1500～2000 lx，光照时间为12 hd1的情况下对苦参进行增殖及生根培养基的优化，试验设计见表1和表2。每个处理6瓶重复，培养35 d后分别统计增殖系数和生根率。
表1不同激素水平对苦参丛芽增殖的影响
组数
培养基
6BA(mg.L1）
2，4D（mg.L1）
NAA（mg.L1）
A
MS
1.0
0
0.5
B
MS
1.0
0
0.2
C
MS
0.5
0
0.2
D
MS
0.5
0.5
0
E
MS
0
0
0
注：6BA：6苄基腺嘌呤；2,4D：2,4二氯苯氧乙酸；NAA：a 萘乙酸
表2 生根培养基的因素和水平
水平
因素
NAA（mg.L1）
IBA（mg.L1）
1
0.1
1.0
2
0.2
2.0
3
0.3
0
注：NAA：a 萘乙酸；IBA:吲哚丁酸
1.4.2 同源四倍体的诱导
1.4.2.1 秋水仙素溶液的配置 分别取0.05 g、0.1 g、0.2 g的秋水仙素置于小烧杯中，加几滴乙醇，搅拌，使其溶解充分，再倒入到100 mL的容量瓶中，加蒸馏水定容至100 mL，再加入12滴2 gmL1二甲基亚砜（DMSO）。分别倒入标有0.05%、0.1%、0.2%的锥形瓶中。再在无菌操作台上用抽滤的方法除去秋水仙素溶液中的细菌，而用封口膜密封好放在低温、黑暗的条件下待用。
1.4.2.2 秋水仙素浸泡法 在无菌操作台上获取组培苗的茎尖，并将其分别浸泡于浓度为0.05%、0.1%、0.2%的秋水仙素溶液中，浸泡时间分别为12 h、24 h、36 h、48 h，使茎尖与秋水仙素充分接触后置于摇床上。处理结束后，到无菌操作台上，将经秋水仙素诱导的茎尖取出，放在灭菌过的无菌水中清洗3次，经滤纸上吸干水分后接入到MS培养基中。

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