为研究菘蓝生殖生长过程中开花的分子调控机制，本文以亳州菘蓝自交植株为材料，首次克隆得到菘蓝EMF基因的CDS序列，命名为IiEMF，其序列全长1896 bp，预测编码的蛋白质长度为632个氨基酸。通过对其蛋白质序列比对及进化树分析，发现菘蓝与多种植物的EMF序列存在较高的同源性。实时定量PCR分析结果显示IiEMF基因在不同器官中均有表达且具有显著差异，其表达量为叶＞根＞茎＞花＞果实。同时，在菘蓝不同的发育阶段IiEMF基因的表达量不同，在叶片中表达量呈先升后降的趋势，初花期最高；在花蕾中表达量最高，花果期花中表达量最低。
目录
摘要2
关键词2
Abstract2
Key words2
引言（或绪论）2
1 材料与方法3
1.1 实验材料及引物设计3
1.2 克隆方法 3
1.2.1 菘蓝组织RNA的提取4
1.2.2 cDNA第一链的合成 4
1.2.3 PCR扩增 4
1.2.4 目的片段的回收 4
1.2.5 加尾PCR及目的片段连T载体4
1.2.6 连接产物的转化 4
1.2.7 重组质粒的PCR检测及测序4
1.3 生物信息学分析5
1.4 菘蓝IiEMF基因表达检测 5
2 结果与分析5
2.1 IiEMF基因的克隆5
2.2 IiEMF基因的生物信息学分析 6
2.2.1 IiEMF基因cDNA序列同源性分析6
2.2.2氨基酸序列分析和结构域分析 8
2.2.3 IiEMF蛋白的高级结构预测 9
2.3 IiEMF基因在菘蓝不同器官中的表达10
3 讨论 11
致谢12
参考文献12
菘蓝开花基因IiEMF的克隆和表达分析
引言
菘蓝（Isatis indigotica Fort.）为十字花科（Cruciferae）越年生药用植物，药用部位为根与叶，根入 *51今日免费论文网|www.jxszl.com +Q: ^351916072^ 
药为板蓝根，叶入药为大青叶[1]，二者均性寒味苦，具有清热解毒、凉血消斑的功效 [2]。在菘蓝的栽培生产过程中，多使用种子进行繁殖，且菘蓝花期自交结实率很低，自交不亲和性较强，采用菘蓝杂种优势制种是一个较有效的育种方式[3~4]。目前菘蓝的研究中多集中于其营养生理及栽培生理生化等方面[5~7]，但对其生殖生长过程的研究较少。而通过研讨菘蓝生殖生长过程中开花分子调控机制，可以有效的提高优质种子的获得，有利于优良种质资源的挖掘，为其分子育种奠定基础。
植物开花受众多内源因子和外部环境因素的共同调控，是植物生长周期中的重要发育过程，是由营养生长向生殖生长的转变[8]。当植物营养生长至一定时期后，在外界环境因素如温度、营养及胁迫压力、日照长度等的诱导下，刺激内部遗传因子如糖含量、昼夜节律、植物激素及生长年龄等的表达，促使其开花[9~11]。通过对模式植物拟南芥成花调控机制的研究，明确了6条主要的调控植物开花诱导的途径：春化途径、年龄途径、自主途径、温度途径、光周期途径和赤霉素途径[12~13]。
在植物开花调控网络中，EMF（EMBRYONIC FLOWER）基因是抑制植物开花的重要基因，决定着植物营养生长时期的发育情况，是维持植物正常营养生长的一个应激基因。当EMF基因的抑制作用解除后，植物才能实现营养生长向生殖生长的转变[14~15]。目前已从菊花、西兰花、拟南芥、马尾松等植物中克隆得到EMF基因，并进行了功能研究，证实了EMF是调控植物营养生长及生殖生长的主要基因[16]。其中，EMF1和EMF2基因在植物生长发育整个过程的大部分器官中都有表达。EMF1在叶片、根、茎等营养器官和花中都有表达，EMF1基因抑制植物开花且在花器官中检测到其表达水平更高，说明EMF1基因属于组成型表达[17]。EMF2同样也在幼叶、茎、根及花中都有表达，而在模式植物拟南芥中，EMF2基因的缺失能使植物不通过营养生长直接开花，但超量表达EMF2基因没有使开花时间提前，同时了解到EMF2与CLF基因是作用于同一条途径，通过调控相关促进开花时间基因来抑制开花的[18]。研究表明，植物的营养生长是对植物生殖生长抑制的结果。拟南芥EMF2基因缺失的突变体跳过了营养生长，种子萌发后便开花，这说明EMF2基因是植物营养组织中的开花抑制基因，在植物花器官发育过程中发挥重要的作用[18]（。在拟南芥营养生长阶段，EMF基因抑制下游开花基因的表达，EMF基因的表达量随着植物生长发育逐渐降低，同时开花基因的表达量增高，当EMF的表达降低到一定水平时，植物由营养生长转换为生殖生长[19]。
菘蓝和模式植物拟南芥同属十字花科植物，通过对其开展EMF基因的分离、克隆，分析其生殖生长过程中不同器官、不同时期内的EMF基因的表达情况，为进一步研讨菘蓝EMF基因调控开花的机理，阐明EMF基因在菘蓝发育过程中的作用提供理论依据，对菘蓝的栽培繁殖及优产高产具有重要意义。
1 材料与方法
1．1 试验材料及引物设计
试验材料为亳州菘蓝居群的自交一代的种子，于2015年5月播种，常规管理至2016 年2月27日时开始取样，4月7日（果实期）全株取样后立即置于液氮中70℃保存，用于后期RNA的提取，同时分别取2月27日（抽薹现蕾期）、3月7日（初花期）、3月31日（盛花期）、4月7日（花果期）的根、茎、叶以及花蕾或花，置于液氮中，70℃保存。其中花果期的样品用于基因克隆分析，通过实时荧光定量PCR技术对所有时间点的样品进行分析。基因序列（TRINITY_DN66245_c2_g3）来源于菘蓝转录组数据库，应用Primer Premier 5软件设计克隆引物（EMF01F，EMF01R）如下表1，由擎科（南京）有限公司合成。
表1 菘蓝EMF基因克隆和表达分析的引物
Table 1 Primers used for amplification and expression analysis of EMF in Isatis indigotica
EMF01F：
EMF01R：
5′ATGGGGAGAAAGAAACTCGAAATCA3’
5′CTAATTAAGCAGCGGGAGCGTTACC3’

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