菊科植物独特的头状花序在其每个属中各有不同，成为鉴别和分类的要素之一。2015版药典描述了不同品系药用菊花的植物学特征，其中性状特征的鉴别主要为舌状花与管状花的形态，且药用菊花的指标性成分含量与花型有密切的关系，所以对药用菊中控制花形态的基因进行研究具有一定价值。本试验克隆了早小洋菊CYC2的一个同源基因（暂命名为ZxyCYC2c），并对其进行生物信息学分析；以β-actin为内参基因，使用Real-time PCR检测ZxyCYC2c在头状花序中的相对表达量。克隆得到一条开放阅读框长900 bp，编码300个氨基酸的ZxyCYC2c基因，构建进化树发现ZxyCYC2c与其它品种的菊科植物有很高的同源性，另外根据蛋白相似性度程度对比发现ZxyCYC2c基因与甘菊的花对称性调控相关基因CICYC2c相似度为99%，因此推测二者具有相似功能。Real-time PCR结果表明ZxyCYC2c在舌状花中显著性表达，为后期研究药用菊花花对称性分子机理的研究打下基础。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言 1
1 材料与方法2
1.1 实验材料 2
1.1.1 植物材料2
1.1.2 主要仪器2
1.1.3 主要试剂2
1.1.4 试验引物2
1.2 实验方法3
1.2.1菊花‘早小洋菊’花序总RNA提取及cDNA的合成3
1.2.2 ZxyCYC2c基因的克隆3
1.2.3生物信息学分析4
1.2.4荧光定量PCR分析5
2试验结果 5
2.1 ZxyCYC2c的克隆结果5
2.1.1 ZxyCYC2c基因的理化性质结果5
2.1.2 ZxyCYC2c基因的系统发育树结果6
2.2 ZxyCYC2c荧光定量表达结果7
3 讨论 7
3.1 蛋白质预测结果分析 8
3．2 氨基酸序列对比与进化树结果分析8
3.3 荧光定量结果分析 9
3.4 展望 9
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参考文献9
早小洋菊CYC2基因的克隆
引言
药用菊花（Chrysanthemum morifolium Ramat.）为植物菊的干燥头状花序，是一类大宗药材，性甘、苦，微寒，归肺、肝经；具有散风清热，平肝明目，清热解毒的功效。可用于治疗风热感冒，头痛眩晕，目赤肿痛，眼目昏花，疮痈肿毒。目前按照产地和加工方式的不同，将药用菊花分别分为‘杭菊’、‘亳菊’、‘滁菊’、‘贡菊’、‘怀菊’、‘祁菊’、‘济菊’和‘川菊’等8大栽培品系[1]。其中，杭菊最早以茶用菊开始种植，其道地产区为浙江桐乡，主要有早小洋菊、晚小洋菊、大洋菊、异种大白菊和小汤黄等传统类型[2]。随着人工引种，江苏射阳、山西芮城、湖北麻城开始已有大面积杭菊种植[3]。随着引种环境的变化，不同产地的杭菊在植物学形状上也发生显著性变化[4]，这种变化主要体现在其头状花序上。
近年来，现代科学技术的进步使人们对菊花的了解越来越深入，但是目前国内外对于菊科植物中控制药用菊花花形态相关基因的研究很少，多是关于观赏菊的。在药用菊花方面，有关影响其化学成分的因素的研究发现，药用菊花的指标成分含量和其花型有着密切的联系。前人相关研究显示MYB转录因子作为植物中最大的转录因子家族之一，在不同物种中调节黄酮醇合成时的形式也不同；在拟南芥中发现控制花型的TCP家族转录因子可以与MYB家族的AtMYB12和AtMYB111互作，促进黄酮醇的合成[5]， 以这一点为提示联想到药用菊花中含有丰富的黄酮类化合物，其中黄酮醇是植物中黄酮类化合物丰度较高的一类物质，常以单糖、双糖或三糖苷形式存在，在黄酮生物合成途径中属于中上游产物；药用菊花化学成分中的槲皮素(quercetin)就属于黄酮醇类化合物，作为植物界分布最广、最常见的黄酮醇类化合物，槲皮素发挥着重要的药理作用。随着分子生物学技术被越来越多的应用在中药鉴定以及质量评价的领域中，研究黄酮醇类化合物的转录调控可以为下游的类黄酮产物的合成及调控提供研究基础。
综上所述，本试验从药用菊花中克隆获得控制花对称性的相关基因，拟揭示药用菊花中花形态控制基因的表达模式，可为研究杭菊的道地品质形成提供理论依据；为进一步分析药用菊花指标性成分和其花形态的关系提供良好的思路；也可为日后在生产应用方面对药用菊花品质评价提供一个新方向。
1 材料与方法
1．1 实验材料
1．1．1 植物材料
植物材料经大学中药材研究所汪涛副教授鉴定为杭菊品系中的早小洋菊后，于大学药用菊花种质圃采集。当杭菊到收获期时，参照郭巧生[6]药用菊花头状花序开放程度标准，挑选舌状花开放70%、管状花开放50%的花序进行采集，采集样品时选择生长一致的头状花序，用液氮冷冻，并保存在80℃冰箱中备用。
1．1．2 主要仪器
PTC200 PCR仪（美国Alpha公司）；ABI Step One Real—time PCR仪（美国ABI公司）；JBQZD16全温振荡器（常州普天仪器制造有限公司）。
1．1．3 主要试剂
表1 试剂
Table 1 reagent
试剂盒
品牌
胶回收试剂盒
高保真酶
cDNA第一链合成用试剂盒
定量用反转录试剂盒
荧光定量试剂盒
植物RNA提取试剂盒
TaKaRa Mini BEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0
PrimeSTAR® Max DNA Polymerase
PrimeScript™ II 1st Strand cDNA Synthesis Kit
PrimeScript™ RT reagent Kitwithg DNA Eraser
SYBR® Premix Ex TaqTM II Tli RNaseH Plus
TaKaRa MiniBEST Plant RNA Extraction Kit
注：以上试剂均于宝生物工程（大连）有限公司购置

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