基于菘蓝转录组，鉴定编码完整WRKY结构域蛋白的IiWRKY基因，为解析菘蓝WRKY基因功能及其胁迫响应机制奠定基础。利用TBtools、ExPASy、MEGA7.0、MEME5.1.0、STRING等生物信息学工具对菘蓝WRKY家族的系统发育关系、蛋白质保守结构域、保守元件、基因功能等进行预测和分析；通过qRT-PCR分析菘蓝WRKY在不同组织（根、叶、叶柄）和不同非生物胁迫（低氮、干旱、盐、高温）处理下的表达情况。结果表明，菘蓝49个IiWRKY成员分为Ⅰ（13个）、Ⅱ（26个）、Ⅲ （10个）3类；同一类或亚类内成员具有相同的保守元件；IiWRKY蛋白具有高度保守的WRKYGQK基序，及其两个变体基序WRKYRQK和WRKYGKK；49个WRKY基因在不同组织中的表达模式存在明显差异，且在非生物胁迫条件下有23个IiWRKY基因的表达量显著上调，并推断这些基因是潜在的胁迫应答基因。研究结果不仅为分析菘蓝WRKY基因提供了有价值的信息，也为进一步研究菘蓝WRKY转录因子在调控非生物胁迫中的作用奠定了相关理论基础。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key word 1
引言 1
1 材料与方法 2
1．1 IiWRKY基因的序列检索与鉴定 2
1．2 IiWRKY基因的多序列比对、保守元件鉴定及系统发育分析 2
1．3 植物材料和非生物胁迫处理 3
1．4 菘蓝IiWRKY基因表达分析 3
2 结果与分析 4
2．1 菘蓝IiWRKY转录因子的鉴定 4
2．2 IiWRKY蛋白系统进化树的构建与多序列比对 5
2．3 菘蓝IiWRKY转录因子保守元件分析 6
2．4 菘蓝IiWRKY蛋白的功能鉴定 8
2．5 菘蓝IiWRKY的组织特异性表达分析 8
2．6 菘蓝IiWRKY基因在非生物胁迫下的表达分析 9
3 讨论 11
4 结论 12
致谢 12
参考文献 12
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表 2 菘蓝WRKY家族基因信息 4
图 1 菘蓝和拟南芥WRKY蛋白的系统发育树 5
图 2 49个IiWRKY蛋白WRKY保守结构域分析 6
图 3 菘蓝IiWRKY蛋白的无根系统发育树和保守元件分析 7
图 4 IiWRKY家族的GO分析 8
图 5 菘蓝特定组织中IiWRKY基因的相对表达水平 9
图 6 不同的非生物胁迫条件下49个菘蓝IiWRKY基因的表达谱 10
图 7 低氮(LN)响应的IiWRKY基因在不同阶段的表达模式 10
菘蓝WRKY转录因子家族的基因鉴定和功能分析
学生 张慧博
引言
引言
菘蓝（Isatis indigotica Fortune.）是十字花科（Cruciferae）的二年生草本植物，其干燥叶和干燥根分别称为大青叶和板蓝根[1]，二者具有抗白血病、抗菌、消炎和抗内毒素等作用。WRKY作为高等植物中十个最大的转录因子家族之一，在植物界中广泛分布。WRKY蛋白名称源于一段保守的WRKY结构域，该结构域长度约为60个氨基酸残基，包括N末端保守的七肽WRKYGQK基序和C末端的锌指结构，其中WRKYGQK 七肽有 WRKYGKK、WRKYDQK 和 WRKYDHK等多种变型，锌指结构包括CX45CX2223HXH （C2H2型） 和CX7CX23HXC（C2HC型）两种类型。根据WRKY结构域的数量和锌指结构的差异将WRKY基因家族划分为为三大类：具有两个WRKY结构域的为第Ⅰ类；具有一个WRKY结构域的则属于第Ⅱ类或第Ⅲ类；第Ⅰ类和第Ⅱ类均包含C2H2型锌指，而第Ⅲ类具有C2HC型锌指；根据蛋白质的一级结构，第Ⅱ大类进一步划分为Ⅱa至Ⅱe五个亚类[2]。除了以上结构域以外，部分WRKY蛋白还包含核定位信号（NLS）、亮氨酸拉链、富含丝氨酸/苏氨酸结构域、富含谷氨酰胺结构域和激酶域等结构[3, 4]。WRKY蛋白通常优先结合靶基因启动子区域中的顺式作用元件Wbox（TTGACT/C），以正向或负向调节靶基因的表达[5]。但有研究表明，某些WRKY蛋白也可以识别和结合一些非Wbox元件包括PRE4（TGCGCTT）、SURE （TAAAGATTACTAATAGGAA）和WK盒（TTTTCCAC）等[6, 7]。
WRKY转录因子是植物生长发育过程中的重要调节因子，AtWRKY6基因在拟南芥衰老过程中表达显著上调，并在这一过程中发挥着重要调控作用[8]；AtWRKY41蛋白通过调控ABI3基因表达从而打破种子休眠[9]。WRKY转录因子在调控植物抗病和适应非生物胁迫中也具有重要意义。GhWRKY391基因过表达时，棉花（Gossypium hirsutum）对细菌性病原体青枯雷尔氏菌（Ralstonia solanacearum）的抵抗力更强，且对真菌性病原体立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）的耐受性提高[10]。棉花GhWRKY41和番茄（Solanum pimpinellifolium）SpWRKY1的过表达增强了转基因烟草对盐胁迫和干旱胁迫的抗性[11, 12]；OsWRKY11的过表达能够增强水稻（Oryza sativa）对热和干旱的耐受性[13]。在养分胁迫下，AtWRKY75、AtWRKY6和AtWRKY42参与调控拟南芥获取磷酸盐的过程[14]。随着高通量测序技术的发展，许多植物物种中已经鉴定了WRKY基因家族成员，其中包括拟南芥中的72个[15]、水稻中的102个[16]、黄瓜（Cucumis sativus）中的55个[17]、葡萄（Vitis vinifera ）中的59个[18]、番茄中的81个[19]和丹参（Salvia miltiorrhiza）中的61个[20]等。同一物种的WRKY家族中不同成员既协同互作又相互拮抗，作为调节枢纽之一在植物逆境响应网络中起到重要作用。目前，对WRKY转录因子在环境胁迫中发挥作用的研究报道越来越多，研究范围逐渐从最初的模式植物到其他普通植物及药用植物并不断扩大，然而菘蓝中关于WRKY转录因子的报道非常有限，基因家族的成员仍有待鉴定。在此研究中，通过对菘蓝的转录组分析鉴定出了49个IiWRKY基因，分析了系统发育关系并进行了序列比对，研究了49个IiWRKY基因在不同组织和非生物胁迫下的表达谱，以初步阐明IiWRKY基因在菘蓝非生物胁迫应答机制中的作用，并为菘蓝抗逆育种的研究奠定一定的理论基础。

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