目的探究蚂蟥冬眠过程中抗氧化酶活性及抗氧化酶基因表达的变化。方法分光光度法测定抗氧化酶（SOD、CAT、GR、GSH-PX）活性的变化，RT-PCR技术测定抗氧化酶基因（SOD、CAT）表达量和代谢酶基因（UQCR、MDH、SDH）表达量的变化。结果表明蚂蟥冬眠初期，抗氧化酶活性会升高，深冬眠期降至最低，早期苏醒期升高至与冬眠初期同样活性水平。SOD基因表达量呈现先降低至最低再升高的变化趋势。CAT、UQCR、MDH、SDH的基因表达量基本呈现出进入冬眠时期和早苏醒时期有增长趋势。结论初冬眠和早苏醒期抗氧化酶活性有所提高，深冬眠时期抗氧化酶活性最低。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法2
实验材料 2
1.2 实验方法2
1.2.1 蚂蟥冬眠诱导及样品制备2
1.2.2 消化道蛋白质提取2
1.2.3 抗氧化酶类活性测定3
1.2.4 引物设计3
1.2.5 消化道总RNA提取3
1.2.6 RNA的鉴定3
1.2.7 cDNA的合成3
1.2.8 RTPCR测定基因表达量4
1.2.9 实验数据处理4
2 结果与分析4
2.1 酶活性结果分析4
2.1.1 SOD活性变化分析4
2.1.2 CAT活性变化分析5
2.1.3 GR活性变化分析5
2.1.4 GSHPX活性变化分析6
2.2 基因表达量结果分析6
2.2.1 SOD基因表达量变化分析6
2.2.2 CAT基因表达量变化分析7
2.2.3 UQCR基因表达量变化分析7
2.2.4 MDH基因表达量变化分析8
2.2.5 SDH基因表达量变化分析8
3 讨论 9
3.1 蚂蟥冬眠期间抗氧化9
3.2 早期苏醒期与未冬眠时期抗氧化对比9
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谢11
参考文献11蚂蟥冬眠期间抗氧化酶活性及抗氧化酶相关基因表达的研究
引言
中药水蛭具有破血通经，逐淤消癥的作用，被普遍应用于中医临床，市场前景十分广阔[1,2]。《中国药典》（2015年版）收载的药材水蛭基原有蚂蟥（Whitmania pigra Whitman）、水蛭(Hirudo nipponica Whitman)和柳叶蚂蟥(Whitmania acranulata Whitman)三种[3]，蚂蟥是目前市场上水蛭药材主要来源。
冬眠（Hibernation）是动物在冬季遭遇低温、食物缺乏等不利环境的情况下，通过降低体温、减小呼吸速率、降低基础代谢率等方式，以在恶劣环境中生存下来[4]。动物在冬眠期间进行的有氧代谢，会产生大量的活性氧、氧自由基等对机体造成不可逆的损伤，因此在动物冬眠期间抗氧化调节显得尤为重要。动物酶类抗氧化系统中超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、过氧化氢酶（catalase，CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶( glutathione peroxidase，GSHPX)、谷胱甘肽还原酶（glutathione reductase，GR）等在抗氧化调节中具有重要作用[5,6]。除去抗氧化防御系统对抗氧化调节起作用外，参与代谢调节的酶通过对代谢过程的调节在抗氧化调节中也具有重要作用。苹果酸脱氢酶（malate dehydrogenase ，MDH）是糖代谢过程中的关键酶，在苹果酸/天冬氨酸穿梭系统中，能够催化线粒体基质中苹果酸和NAD+反应生成草酰乙酸和NADH+H+。生成的NADH通过电子传递链使其分子上的氢原子与氧结合生成水分子。电子传递链体系中的复合物，例如：复合物Ⅱ（琥珀酸脱氢酶，succinate dehydrogenase ，SDH）、复合物Ⅲ（泛醇细胞色素C还原酶，recombinant ubiquinol cytochrome C reductase ，UQCR）在电子传递过程中有重要作用[7]。是在动物休眠过程中，调节抗氧化的酶在不同器官中呈现不同的变化趋势，控制其表达的基因表达量也呈现不同的变化状态[812]。
目前市场对蚂蟥的需求量越来越大，但是受到环境污染、人类捕杀过度的影响，野生蚂蟥资源已经无法满足日益增长的市场需求。因此，人工养殖蚂蟥不仅是一个良好更是必须的解决方法。但是在蚂蟥的大规模养殖中一般没有有效的温度控制系统，而蚂蟥对温度的变化很敏感[13]，所以越冬过程中可能会造成蚂蟥大规模死亡。为了避免这种情况发生所造成巨大损失，除了人力、物力成本较高的改造养殖条件增加温度控制系统方式外，还可以通过改良蚂蟥种质以达到减少越冬过程中死亡率的目的。查阅相关资料，蚂蟥在温度低于5℃时进入冬眠状态，但未见研究蚂蟥冬眠过程中抗氧化酶基因表达量的相关文献。本课题拟通过研究蚂蟥在冬眠期间抗氧相关酶类基因表达量变化和酶活性变化趋势，探究蚂蟥冬眠过程中抗氧化调节的机制，对蚂蟥种质改良有指导意义。
1 材料与方法
1．1 实验材料
Alpha1506紫外可见分光光度计（上海谱光仪器有限公司）、电子天平（山海精密仪器厂）；实时荧光定量PCR仪（美国ABI Step one7500）；PCR仪（PTC200，bioRAD），电泳仪（DYY6C，北京六一仪器厂）；凝胶成像仪（JS380，上海培清科技有限公司）等。
四水合钼酸铵（分析纯）、浓盐酸（36%）、叠氮化钠（分析纯）、邻苯三酚（分析纯）、EDTA（分析纯）、pH为7.4的磷酸缓冲溶液、无菌水、SYBR® Premix Ex Taq™ (Tli RNaseH Plus)(来自：上海皓嘉科技发展有限公司)（荧光定量）；Prime Script .RT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time) (来自：上海皓嘉科技发展有限公司)（反转录）等。
实验用蚂蟥由大学中药材研究所提供，经郭巧生教授鉴定为蚂蟥Whitmania pigra Whitman。

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