:目的了解蚂蟥生殖周期性类固醇激素的相关变化规律。方法运用酶解、萃取以及Uplc-Ms/Ms检测蚂蟥生殖周期中4种性类固醇激素。结果蚂蟥雌三醇含量自4月龄逐渐上升，5月龄急速上升，6月龄达到最大值，7月龄急速下降,，8月龄又上升至极大值，之后逐渐下降；蚂蟥的雌酮的变化趋势基本和雌三醇变化趋势相同，5月龄开始明显的上升，在6月龄达到最大值，7月龄急速下降，8月龄又上升至极大值，之后逐渐下降；蚂蟥的睾丸酮3-6月龄缓慢上升，6-9月龄缓慢下降，9月龄含量达到最小值，之后极速上升，在11月龄达到了最大值；蚂蟥的黄体酮除了1、4、9、11四个月龄外均处于较大值，10月龄为最大值，11月龄快速下降至最小值。结论:6月龄的蚂蟥雌性激素含量达到最大值，10月龄蚂蟥孕激素含量达到最大值，10-11月龄的蚂蟥雄性激素急速上升达到最大值，蚂蟥性类固醇激素同步于性腺分化。
目录
摘要 1
引言
引言
蚂蟥为环节动物门蚂蟥科动物蚂蟥（Whitmania pigra Whitman）的干燥全体[1]，又称宽体金钱蛭[2]随着市场的发展，中成药及保健产品中以蚂蟥为原料的药品和保健品日渐增多,蚂蟥的野生资源日益枯竭,导致蚂蟥的价格不断飙升，因此蚂蟥的人工养殖工作已受到业界高度重视。
蚂蟥的雌雄性腺发育过程并不一致，性类固醇激素对动物性腺分化起着十分重要的作用，也是动物性腺分化的基础，近年来蚂蟥的研究多注重于药理和药效及生理方面的比较研究[35]，但国内尚没有关于蚂蟥生理周期性类固醇激素含量检测的报道。
性类固醇激素的检测中性激素的前处理方法是关键，需要根据目标的不同，通过改变提取、净化的条件，探索最合适的方法，尽可能的除去杂质，提高检测物质的纯净度。检测方法中包括：分光光度法，由于此方法的特异性差，灵敏度低，对于结构相近、相似的化合物无法分别等缺点，所以在研究初期有过使用，不过早已经被淘汰；免疫学检测法，灵敏高、特异性强、操作简单、价格低廉，能够实现对生物液体的小体积、大通量检测，并且逐渐成为有毒有害残留物检测的替代方法之一；高效液相色谱法(HPLC)，具有高效、分析速度快，分析范围广、操作简单等优点,所以一般用于化妆品、牛奶等性激素种类较少、成分不太复杂的检测;气象色谱(GC)，单一的GC随着技术的革 *景先生毕设|www.jxszl.com +Q: #351916072# 
新，逐步减少，相应方法的检测已经不能满足时代的要求，因此被气象色谱串联质谱（GC/MS）的方法取代; 气相色谱串联质谱法(GC/MS)，分离能力强、分离速度快、灵敏度高等优点，以及质谱拥有的结构鉴定的能力，使得此方法成为激素检测中主要的检测方法之一。但是此方法也有一些不足，例如：必须检测纯净的物质。因此前处理过程比较复杂，要求较高，需要衍生化，在一定程度上降低了灵敏度，并且分析速度和LC/MS相比较长。(五)高效液相色谱串联质谱法(LC/MS) [611]，基于高效液相质的优点，并且质谱有结构鉴定的能力，提高了检测的灵敏度和准确性，并且LC/MS和GC/MS相比，前处理过程中一般不需要衍生化，排除了气相色谱离子束的干扰。以电喷射和气压化学离子法进行离子软化，有效提高了检测限，并且使之耗时较短，使之成为常规临床检测的理想方法。李向军等利用高效液相色谱串联质谱法同时测定水产品中24种性激素；秦燕等利用液相色谱质谱检测方法动物肌肉组织中甾类同化激素多组分残留。使用LCMS的方法对多种水产品中性类固醇激素的检测实例，表明了液相色谱质谱法已经是对水产品中性激素残留检测的一个主要手段,因此本实验采用LC/MS方法。
本实验研究综合了鱼类、黄鳝等多种动物内源激素的提取、检测方法，运用 UPLCMS/MS对生殖周期中各月龄（111月龄）的蚂蟥进行4种激素含量的检测，旨在了解雌三醇、雌酮、睾丸酮、黄体酮在各各月龄的变化规律，为蚂蟥性类固醇激素的研究打下基础并且为蚂蟥人工养殖及有关标准的制订提供科学依据。
1 材料与方法
1.1实验材料和试剂
蚂蟥由大学中药材研究所提供，经郭巧生教授鉴定为蚂蟥W.pigar，分别在蚂蟥出卵茧后的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11月龄末时取样， 196℃液氮保存。其中1月龄为6月份的蚂蟥（后面以此类推11月龄为次年4月份的蚂蟥。）；甲醇、乙酸、乙酸钠、B葡萄糖苷酸酶、氯化锌、正丙醇、雌三醇标准品、雌酮标准品、睾丸酮标准品、黄体酮标准品。
1.2 仪器
FA1104分析天平(上海精科天平),KQ250B超声仪(昆山市超声仪器公司), 5810R离心机(Eppendorf公司), HHS型水浴锅（予华仪器有限责任公司），旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器公司）,漩涡混匀仪(江苏海门市其林贝尔仪器制造有限公司) ，水浴氮吹仪(上海允延仪器有限公司)，美国Waters ACQUITY UPLCTM液相色谱仪, ACQUITY UPLC® HSS T3色谱柱(2.1 ×100mm,1.8μm),AB Sciex QTRAP® 5500质谱仪，AB Analyst® 1.6.2 工作站，岛津 Cto30A柱温箱，岛津LC30AD 输液泵，岛津SIL30AC 自动进样系统，岛津DGM20A脱气系统。
1.3 取样方法
每个月龄根据蚂蟥体积大小随机选取只620只，在液氮条件下研磨，混匀后随机量取5g.
1.4 激素测定方法
1.4.1 实验提取步骤 取已粉碎均质化的样品5.0g（准确至0.1g），置于50ml具塞塑料离心管中，加入0.2mol/L（1.64g配100ml）的乙酸乙酸钠缓冲溶液（PH5）10ml，再加入酶解液50µl（采用B葡萄糖苷酸酶制剂对样品中可能存在的两种结合态性激素进行酶解，101400u/ml）于37℃水浴振荡器中酶解12h以上。取出，冷至室温，加入15ml甲醇超声提取15min，于10000r/min下离心10分钟，上清液转入另一洁净离心管中；残渣再以15ml甲醇重复提取1次。合并上清液，并向其中加入2g的氯化锌固体，搅拌至氯化锌完全溶解。此时有沉淀析出，10000r/min下离心10min，上清液转入锥形瓶中，加入5ml正丙醇溶液，于45℃，8kPa条件下旋转蒸发至约1ml,加入1ml甲醇超声溶解后，再加入10ml水稀释，待净化。预先以5mL甲醇、5mL水活化平衡LCC18柱,用5mL甲醇活化LCNH2。然后将上述提取液全部加入LCC18中;以5mL甲醇水(体积比为10:90)洗涤锥形瓶并作为淋洗液淋洗LCC18柱。抽至近干后，下端接上LCNH2柱,再用6mL甲醇洗脱;将LCC18柱去掉后,以2mL甲醇洗脱LCNH2柱,收集所有甲醇洗脱液并于50℃下用N2吹干;残渣中加入1mL甲醇水(体积比为80:20),超声溶解30s,漩涡混匀30s,过0.2µm滤膜,滤液供分析。

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